多肽偶联壳聚糖纳米粒给药载体的构建及体外靶向分布研究

发布时间：2019-07-22 11:04

【摘要】：目的：合成多肽偶联壳聚糖，制备多肽偶联壳聚糖川芎嗪纳米粒（多肽壳聚糖纳米粒， pEGF-CS-TMP-NPs），研究其体外靶向性与靶向分布机制。方法： 1.氧化降解法制备低分子量壳聚糖。乌氏粘度计测定不同浓度过氧化氢、不同降解时间下壳聚糖的特性黏度，Mark-Houwink方程计算壳聚糖分子量。分析壳聚糖降解前后红外光谱结构表征。 2.以2-亚氨基硫烷盐酸盐为偶合剂制备巯基壳聚糖，优化巯基壳聚糖合成工艺。将表皮生长因子受体（EGFR）特异性配体多肽（pEGF）通过分子内二硫键修饰于巯基壳聚糖表面合成多肽偶联壳聚糖。红外光谱、核磁共振光谱分析产物的结构表征。各产物元素含量通过元素分析仪测定。 3.离子交联法制备多肽壳聚糖纳米粒，透射电镜观察多肽壳聚糖纳米粒的形态，激光粒度分析仪测定粒径、分散度、Zeta电位，高效液相色谱法测定包封率、载药量。 4.体外恒温振荡法模拟体内释药环境，对多肽壳聚糖纳米粒组、壳聚糖川芎嗪纳米粒组（壳聚糖纳米粒）、川芎嗪溶液组释药情况分别进行考察。pH值为7.4、7.0、6.5，于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、96、120h取样，高效液相色谱法检测各组药物浓度，计算各组累计释放度。 5. MTT法检测细胞毒作用。选取人肝癌细胞SMMC-7721（EGFR高表达）、人白血病细胞K562（EGFR阴性表达）。分别给予浓度为0.03、0.06、0.12、0.25、0.50、0.62mg mL-1的多肽壳聚糖纳米粒和相当载体量的空纳米粒，给药48h，吸光度通过酶标仪检测。用origin软件计算两种细胞、两种制剂的IC95。 6.多肽壳聚糖纳米粒体外靶向分布研究。实验组SMMC-7721给予无毒剂量的多肽壳聚糖纳米粒，对照组SMMC-7721给予相应剂量壳聚糖纳米粒以及川芎嗪溶液，K562给予相应剂量的多肽壳聚糖纳米粒。分别作用1、2、4、6、8、10h时取样，高效液相色谱法检测细胞内川芎嗪浓度。给药4h，激光共聚焦显微镜观察各组细胞内川芎嗪荧光强度。 7.竞争结合实验探讨多肽壳聚糖纳米粒靶向分布机制。选取SMMC-7721与K562细胞，给予无毒剂量的多肽壳聚糖纳米粒；对照组选取上述两种细胞，分别用游离pEGF进行处理，再加入多肽壳聚糖纳米粒。作用4h后，各组细胞内川芎嗪荧光强度通过激光共聚焦显微镜检测。结果： 1.壳聚糖的相对分子质量随降解反应时间的延长而降低，且过氧化氢浓度越大降解效率越高。选取3%过氧化氢、降解90min为反应条件，得到壳聚糖分子量约为3104作为合成巯基壳聚糖原料。红外结果表明降解后壳聚糖结构单元并没有改变，仅糖苷键发生断裂。 2.合成巯基壳聚糖。与壳聚糖相比，其红外图谱在1621cm-1新出现-C=N的伸缩振动峰。核磁图谱显示，巯基壳聚糖在δ2.7、δ1.9处出现新的位移值，说明巯基连接到壳聚糖分子表面。在对巯基壳聚糖工艺优化过程中发现，在pH=6.2时，巯基含量较高，并选择壳聚糖与2-亚氨基硫烷盐酸盐的质量比为2:1用于制备巯基壳聚糖。所合成的多肽偶联壳聚糖核磁图谱与壳聚糖相比，δ7.1，δ7.0，δ6.8处新增加三个位移值，分析此为氨基酸中的芳香氢。元素分析结果显示，多肽壳聚糖中N、S的含量都有所增加，因此可以判断pEGF已偶联到壳聚糖分子上。 3.HPLC法测得多肽壳聚糖纳米粒的包封率为37.660.53%，载药量为3.240.37%。激光粒度仪测得该纳米粒的粒径为164.37.1nm，分散度(PDI)为0.0530.006，Zeta电位为19.732.18mv。多肽壳聚糖纳米粒形态成圆球形，分布均匀。 4.释放度结果显示多肽壳聚糖纳米粒具有缓释作用，当pH为7.4，释放时间120h时，累积释放度达到91%。随着pH值降低，多肽壳聚糖纳米粒累积释放度升高，在pH6.5条件下，纳米粒累积释放度最高。 5.多肽壳聚糖纳米粒对SMMC-7721、K562的0.153mg mL-1、0.253mg mL-1。空纳米粒对两种细胞的IC95约为0.8mg mL-1。 6.经HPLC方法测定，随着给药时间的延长，两种细胞内药物浓度均增加，4h达到饱和。经给药SMMC-7721细胞内浓度由高到低依次为多肽壳聚糖纳米粒组（37.530.28μg mL-1）、壳聚糖纳米粒组（26.670.36μg mL-1）、溶液组（23.510.25μg mL-1）。K562组药物浓度为25.810.58μg mL-1。多肽壳聚糖纳米粒组细胞内浓度与其它组相比均有显著性差异（p0.05）。激光共聚焦显微镜下观察发现，实验组细胞内川芎嗪荧光强度显著高于对照组。 7.激光共聚焦显微镜结果显示，加入游离pEGF后，SMMC-7721细胞内药物荧光强度显著降低，K562细胞内药物荧光强度无变化。说明多肽壳聚糖纳米粒的靶向机制是通过特异性识别EGFR进入细胞。结论：本实验合成了新型给药载体材料多肽偶联壳聚糖，制备了理化性质稳定的多肽壳聚糖川芎嗪纳米粒，粒径小于200nm，，分散均匀并具有缓释作用。体外实验表明该制剂对EGFR高表达的人肝癌细胞SMMC-7721具有靶向性，其靶向分布机制可能是通过细胞表面EGFR介导的细胞内吞作用实现的。
【图文】：
巯基壳聚糖反应过程

大连医科大学硕士学位论文巯基壳聚糖的合成巯基壳聚糖的合成反应过程如图 1，取上述方法降解后分子量约 3 104的壳聚糖 0.5g，溶解于25mL 1%的醋酸，得到质量分数为 2%的壳聚糖醋酸溶液，过滤。用 5 mol L-1NaOH调节溶液 pH 值 5.8～6.3，在磁力搅拌条件下，分别加入不同浓度的 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2-Iminothiolane)，30℃避光反应 8h，反应体系充氮气。将产物装入透析袋中，10℃避光透析。5 mol L-1HCl 透析一次，含 1%的 NaCl的同样介质透析两次，5 mol L-1HCl 透析一次，最后于 1mol L-1HCl 透析一次，每次透析时间均为 24h。-40℃冷冻干燥，4℃保存备用[13]。2.22.2.1
不同浓度H2O2降解时间与壳聚糖分子量的关系

含川芎嗪浓度 50μg mL，游离 pEGF 浓度为 1μg mL。给药 4h 后，焦显微镜下观察细胞内荧光强度并拍照。学处理组实验均重复做 3 次，统计学分析采用 SPSS19.0 软件进行分析，所得标准差表示。组间两两比较采用最小显著差异法 t 检验（LSD-t）进，p＜0.05 为差异有统计学意义。结果壳聚糖纳米粒制备聚糖降解聚糖经不同浓度过氧化氢氧化降解后，乌氏粘度计测量结果如图 2。由聚糖分子量随降解反应时间的延长而降低，过氧化氢浓度越大降解效取 3%过氧化氢、降解 90min 为条件，得到壳聚糖分子量约为 3 104作壳聚糖原料。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R943

【参考文献】