携带UCH-L1的外泌体在乳腺癌耐药中的作用及机制探讨

发布时间：2019-08-24 08:09

【摘要】：化疗耐药已成为乳腺癌治疗中一种严峻的挑战。有研究表明,细胞间能通过多种途径进行信息交流,包括通过外泌体将耐药性状传递给受体细胞的途径。在本课题中,我们着重分析携带有UCH-L1蛋白的外泌体在耐药传递中的作用,以及其潜在的临床诊断价值。我们选用人敏感型乳腺癌细胞MCF7/WT细胞和人耐阿霉素型乳腺癌细胞MCF7/ADM进行探究化疗耐药的机制。通过使用CellTiter-Blue(CTB)细胞活力分析显示,MCF7/ADM细胞对阿霉素的耐药指数是MCF7/WT细胞的40多倍。通过检测带有自发红色荧光的阿霉素,从而检测化疗药物在肿瘤细胞中的分布情况。在MCF7/WT细胞中,阿霉素主要聚集在细胞核处,发挥其干扰DNA合成代谢的作用,而在MCF7/ADM细胞中,阿霉素大部分聚集在细胞质和细胞膜中,在细胞核中只有少量的聚集,从而降低了阿霉素对肿瘤细胞的杀伤作用。我们使用蛋白免疫印迹法(Western blot)证明了泛素羧基末端水解酶L1(Ubiquitin carboxyl terminal hydrolase-L1,UCH-L1)、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、细胞外信号调节激酶1/2(Extracellular-signal regulated protein kinase,ERK1/2)以及磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(Phospho-extracellular-signal regulated protein kinase,p-ERK1/2)在MCF7/WT细胞、MCF7/ADM细胞的表达情况,并检测通过siRNA下调UCH-L1-silencing MCF7/ADM细胞中UCH-L1表达,对其UCH-L1、P-gp表达情况以及ERK1/2磷酸化的影响。结果显示,MCF7/ADM细胞中UCH-L1蛋白、P-gp蛋白表达以及ERK1/2磷酸化的程度显著高于MCF7/WT细胞和UCH-L1-silencing MCF7/ADM细胞。结果展示了MCF7/ADM细胞中UCH-L1蛋白可以通过激活MAPK/ERK信号通路提高P-gp中的高表达。在探讨经外泌体传递途径的耐药性状改变时,借助细胞活力实验、流式细胞仪分析和免疫荧光检测证实,MCF7/ADM细胞能分泌携带有UCH-L1蛋白和P-gp蛋白的外泌体进入肿瘤细胞微环境,能被MCF7/WT细胞以时间依赖性方式所吸收,并且能传递耐药细胞的耐药性状。将MCF7/WT细胞与耐药细胞来源的外泌体共培养后,我们通过检测细胞活性发现,MCF7/WT细胞的耐药性提高7倍以上。为了验证UCH-L1蛋白在外泌体耐药传递过程中的作用,我们通过使用UCH-L1特异性抑制剂LDN-57444来阻断其蛋白活性。结果发现,LDN-57444预处理过的MCF7/ADM细胞来源外泌体与MCF7/WT细胞共培养后,发现后者的耐药性较之前没有显著性的升高。在之前的研究中,UCH-L1蛋白在MCF7/ADM细胞中,可通过激活MAPK/ERK信号通路提高P-gp蛋白的表达,我们进一步分析这种机制是否存在于通过外泌体的耐药性状传递中。结果发现,MCF7/WT细胞在与MCF7/ADM细胞分泌的外泌体共培养后,其UCH-L1和P-gp蛋白表达水平提高,同时ERK1/2磷酸化的水平升高。以上结果提示,携带有UCH-L1蛋白的外泌体,不仅携带UCH-L1蛋白进入受体细胞,还激活MAPK/ERK信号通路提高P-gp蛋白的表达,提高受体细胞对阿霉素的抵抗能力。我们收集93例临床乳腺癌患者血浆样本和肿瘤样本,通过免疫组织化学和免疫荧光检测发现,瘤体上UCH-L1蛋白的表达和循环血中外泌体的UCH-L1蛋白表达具有一致性。值得注意的,在化疗前血浆样本中,外泌体携带的UCH-L1蛋白水平和化疗疗效呈现显著的负相关。提示其可作为化疗前预测化疗疗效的一种标志物。我们的研究证明了携带有UCH-L1的外泌体可以传递耐药性状给受体细胞,并且可以作为晚期患者非侵入性化疗耐药诊断指标,协助临床实现更有效的个体化治疗的实施。
【图文】：

阿霉素,细胞活力,耐药性,细胞

B 细胞活力检测 MCF7/WT 细胞和 MCF7/ADM 细胞对阿霉素的耐药性（***P<0CTB assays showing MCF7/ADM had greater resistance toAdriamycin than the pareMCF7/WT.***P<0.001 compared with MCF7/WT cells.分布实验霉素来检测化疗药物的亚细胞分布因具有发红色荧光的特性[77]。使用微镜，可对阿霉素在两株乳腺癌细胞的分布有直观的认识。结果如图素作用 12h 后，在 MCF7/WT 细胞中阿霉素汇聚在细胞核中发挥其药理示阿霉素红色荧光与核染料 DAPI 的蓝色荧光重合；相比之下，MCF霉素分布在细胞膜表面，被排出其发挥药理作用的细胞核内。

阿霉素,标尺,细胞,分布情况

活力检测 MCF7/WT 细胞和 MCF7/ADM 细胞对阿霉素的耐药性（** assays showing MCF7/ADM had greater resistance toAdriamycin than theMCF7/WT.***P<0.001 compared with MCF7/WT cells.布实验来检测化疗药物的亚细胞分布因具有发红色荧光的特性[77]。，，可对阿霉素在两株乳腺癌细胞的分布有直观的认识。结果用 12h 后，在 MCF7/WT 细胞中阿霉素汇聚在细胞核中发挥其霉素红色荧光与核染料 DAPI 的蓝色荧光重合；相比之下，分布在细胞膜表面，被排出其发挥药理作用的细胞核内。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R96

【参考文献】