制备脆弱拟杆菌来源的新型α-半乳糖苷酶单抗用于检测通用型红细胞中的微量残留酶
【图文】：
到1株能稳定分泌α-半乳糖苷酶的单抗的杂交瘤细胞株B7G11。按照常规秋水仙碱阻断法处理。结果显示杂交瘤细胞有96条染色体，接近小鼠脾细胞染色体(40条)和SP2/0细胞染色体(平均60条左右)之和，证明筛选的细胞为小鼠脾细胞和SP2/0的杂交瘤细胞。经单抗类型及亚型检测试剂盒检测鉴定该杂交瘤单抗的亚型为IgG1型。2．3腹水单抗的纯化及特异性鉴定腹水单抗经HiTraprProteinA柱纯化后，通过还原SDS-PAGE可以看到纯化后的抗体为2条带，分别是抗体的重链和轻链，通过非还原SDS-PAGE检测，可以看到纯化后的抗体呈单一条带(图1)。腹水单抗的蛋白浓度是50．7mg/ml，纯化后的样品的蛋白浓度为0．78mg/ml，效价为1∶1×105。用表达脆弱拟杆菌来源的α-半乳糖苷酶的重组菌的全菌体蛋白进行Western印迹实验，可见在60×103左右处有明显条带，说明腹水单抗特异与α-半乳糖苷酶结合(图2)。2．4残留酶检测采用四参数Logistic模型绘制标准曲线(图3)，公式如下:y=(A－D)/［1+(x/C)B］+D式中，A=1．56653，B=－1．43640，C=45．08542，D=0．35376，r2=0．99863。本方法的检测下限为1ng/ml，将待测样品平均值代入公式即得出待测样图1脆弱拟杆菌来源的α-半乳糖苷酶单抗纯化的还原型(A)和非还原型(B)SDS-PAGE图谱M．蛋白质相对分子质量标准;1．上样液;2．上样流出液;3．洗脱液图2脆弱拟杆菌来源的α-半乳糖苷酶单抗特异性的Western印迹鉴定M．蛋白质相对分子质量标准;1．重组菌全菌体蛋白品的残留酶量。洗涤液及红细胞上的残留酶量见表1。酶解后的红细胞经4次洗涤后未能检测到酶的残留，表明第4次洗涤后的红细胞上的残留酶量＜10ng/ml，由此确定酶解红细胞的洗涤次数为4次。图3微量α-半乳糖苷酶检测的标准曲线表1通用型
觳馐约梁屑觳饧釯ǜ迷咏?瘤单抗的亚型为IgG1型。2．3腹水单抗的纯化及特异性鉴定腹水单抗经HiTraprProteinA柱纯化后，通过还原SDS-PAGE可以看到纯化后的抗体为2条带，分别是抗体的重链和轻链，通过非还原SDS-PAGE检测，可以看到纯化后的抗体呈单一条带(图1)。腹水单抗的蛋白浓度是50．7mg/ml，纯化后的样品的蛋白浓度为0．78mg/ml，效价为1∶1×105。用表达脆弱拟杆菌来源的α-半乳糖苷酶的重组菌的全菌体蛋白进行Western印迹实验，可见在60×103左右处有明显条带，说明腹水单抗特异与α-半乳糖苷酶结合(图2)。2．4残留酶检测采用四参数Logistic模型绘制标准曲线(图3)，公式如下:y=(A－D)/［1+(x/C)B］+D式中，A=1．56653，B=－1．43640，C=45．08542，D=0．35376，r2=0．99863。本方法的检测下限为1ng/ml，，将待测样品平均值代入公式即得出待测样图1脆弱拟杆菌来源的α-半乳糖苷酶单抗纯化的还原型(A)和非还原型(B)SDS-PAGE图谱M．蛋白质相对分子质量标准;1．上样液;2．上样流出液;3．洗脱液图2脆弱拟杆菌来源的α-半乳糖苷酶单抗特异性的Western印迹鉴定M．蛋白质相对分子质量标准;1．重组菌全菌体蛋白品的残留酶量。洗涤液及红细胞上的残留酶量见表1。酶解后的红细胞经4次洗涤后未能检测到酶的残留，表明第4次洗涤后的红细胞上的残留酶量＜10ng/ml，由此确定酶解红细胞的洗涤次数为4次。图3微量α-半乳糖苷酶检测的标准曲线表1通用型红细胞制备过程中残留α-半乳糖苷酶的检测检测项目α-半乳糖苷酶含量(ρB/ng·ml－1)红细胞洗涤液上清第1次909．9±73．6第2次132．1±31．5第3次4．7±0．5第4次3．6±1．6第4次洗涤后红细胞－－:未测出，低于检测下限304军事医学2015年4月第39?
【作者单位】： 军事医学科学院野战输血研究所;
【基金】：国家自然科学基金资助项目(81300447)
【分类号】：R943
【参考文献】
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1 徐华;郁成雨;章扬培;;联合应用α-半乳糖苷酶和α-N-乙酰半乳糖胺酶实现红细胞AB→O血型转变[J];中国输血杂志;2008年12期
2 王玲燕;高红伟;金泗虎;李素波;虞立霞;鲍国强;宫锋;;利用新型α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造[J];中国输血杂志;2011年02期
3 高红伟;李素波;鲍国强;檀英霞;王颖丽;章扬培;季守平;宫锋;;一种来源于脆弱类杆菌的α-半乳糖苷酶的理化性质及其酶解B型红细胞的工艺研究[J];中国科学:生命科学;2011年10期
4 王颖丽,由英,高红伟,宫锋,章扬培;B→O血型改造制备通用型血过程中残留工具酶的检测[J];军事医学科学院院刊;2004年06期
5 高红伟;李素波;鲍国强;张雪;徐丽娟;檀英霞;王颖丽;季守平;宫锋;;A→O血型转变制备通用型红细胞过程中残留α-N-乙酰半乳糖胺酶检测方法的建立[J];生物技术通讯;2013年01期
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7 宫锋,吕秋霜,由英,高红伟,鲍国强,高新,李素波,李立立,王颖丽,田曙光,张志欣,张评,章扬培;用α-半乳糖苷酶制备可供输注的人通用型O型红细胞[J];中国实验血液学杂志;2005年02期
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【共引文献】
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4 王玲燕;高红伟;金泗虎;李素波;虞立霞;鲍国强;宫锋;;利用新型α-半乳糖苷酶进行B→O血型改造[J];中国输血杂志;2011年02期
5 高红伟;李素波;金泗虎;王玲燕;王颖丽;张丽;郁成雨;季守平;宫锋;;重组α-N-乙酰半乳糖胺酶工程菌菌种稳定性研究[J];中国输血杂志;2011年03期
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7 郝桂娟;张凯;王学智;张景艳;孟嘉仁;杨志强;李建喜;;α-半乳糖苷酶的研究进展[J];中国畜牧兽医;2013年03期
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3 许姗姗;糖衍生物合成中三甲基硅烷基和苄基区域选择性转化的方法学研究[D];浙江大学;2015年
【二级参考文献】
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8 鲍国强,高红伟,宫锋,高新,李素波,王颖丽,章扬培;基因重组α-半乳糖苷酶的生化性质研究[J];军事医学科学院院刊;2005年02期
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1 本报记者 崔昕;输血医学酝酿革命 血液供给将获改善[N];中国医药报;2007年
本文编号：2529410
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