载血红蛋白PEG-PLGA纳米粒子的构建、生物学作用及其靶向性能的研究

发布时间：2019-09-25 04:38

【摘要】：目前输血面临血源不足、保存和使用中需血液配型、血液保质期有限、血源性疾病的传播及通用性受限等问题。血液代用品是血源不足的必要补充,其中血红蛋白氧载体(Hemoglobin based oxygen carriers,HBOCs)作为血液代用品的一种,为当今研究热点。血红蛋白(Hemoglobin,Hb)作为红细胞中的主要成分起到输氧作用,有望代替血液维持组织氧稳态。通过表面修饰、分子内交联及分子间聚合等方式对游离血红蛋白进行化学修饰以改变其性质,使其安全、有效地替代红细胞的携氧功能。从20世纪90年代开始,多种基于血红蛋白改性的血液代用品进入临床试验的不同阶段,然而临床试验中副反应发生、病死率升高等原因是限制血液代用品临床应用的主要因素。尽管HBOC的安全性问题仍制约其临床应用,但是在血液无法满足输血需求的情况下,HBOC因其挽救生命的作用受到研究者们的关注。纳米载药系统为新型HBOC的设计与研究提供思路。以脂质体或可降解高分子聚合物材料为壳材包裹Hb形成的一类纳米微囊型血液代用品,克服了无基质血红蛋白无细胞膜屏障的缺点。该类HBOC具有避免血管活性,延长血红蛋白半衰期,无需修饰Hb四聚体,防止Hb本身引起的胶体渗透压升高等优点,逐渐成为新一代HBOCs的研究热点。可降解高分子材料机械强度高,可制成多孔性膜,以其为壳材包裹Hb稳定性高,解决了脂质体微囊机械强度低和小分子物质通透性差的局限性,通过控制粒径大小、表面电荷和表面修饰物等有望满足血液代用品的研发需求。目前用可降解高分子材料包裹Hb的研究中以聚乳酸(poly lactic acid,PLA)为代表研究较多。研究发现,在PLA中引入羟基乙酸,即聚乳酸-羟基乙酸(poly(D,L-lactide-co-gly-colide),PLGA),可以增大弹性模量、提高亲水性。同时,PLGA具有良好的生物可降解性及生物相容性,己被美国FDA批准作为药用辅料进入美国药典,近年来已大量应用于缓释药物载体。考虑到HBOC需经静脉大剂量输注,提高纳米粒子的弹性模量和亲水性有望提高生物相容性,因此PLGA相较于PLA可能更适用于HBOCs的研究。另外,聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰不仅能够减少血浆蛋白的吸附作用,减少网状内皮系统的清除作用,而且能够改善生物相容性,维持Hb活性,本研究拟用甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸(methoxy polyethylene glycol-poly(D,L-lactide-co-gly-colide),m PEG-PLGA)包裹牛血红蛋白目的在于获得稳定性高、Hb不易氧化的载Hb纳米粒子(Hemoglobin loaded nanoparticles,Hb Ps)。通过筛选Hb Ps制备工艺,并对其理化性质、在急性失血中的救治效果和生物相容性进行初步评估,探讨Hb Ps作为血液代用品的可行性,为纳米微囊型血液代用品提供实验基础。由于HBOCs粒径小,可以通过管径细的血管向缺氧组织释放氧气,因此HBOCs除了在临床输血中进行全身应用,在心肌梗死、脑梗死等局部缺血损伤中以及提高肿瘤放化疗敏感度也具有应用潜力。鉴于局部缺血疾病无需全身大剂量静脉灌注HBOCs,靶向治疗可提高生物利用率,减轻毒副作用。考虑到HBOCs需参与全身血液循环发挥供氧功能,而磁靶向治疗可以使磁性纳米粒子在磁场作用下富集到病灶部位,去除磁场后在血流作用下进行全身循环,因此本研究将在Hb Ps研究的基础上采用磁靶向治疗策略初步建立一种靶向HBOCs制备关键技术,探讨靶向治疗理念应用于HBOCs研究的可行性。本研究将利用m PEG-PLGA通过双乳法制备载血红蛋白纳米粒子(Hemoglobin loaded nanoparticles,Hb Ps),初步评估Hb Ps的理化参数、生物相容性和有效性,探讨利用m PEG-PLGA制备Hb Ps作为血液代用品的可行性。初步建立靶向HBOCs关键技术,以期为拓宽HBOCs临床应用领域提供理论依据。本课题将分为以下三个部分:一、Hb Ps的制备及其理化性质由于w/o/w双乳法的制备条件温和,制备过程避免了聚合物与蛋白直接接触,适用于包裹Hb这类空间构象与携氧功能关系密切的蛋白质,且制备的纳米粒子稳定性高,因此本研究利用w/o/w双乳法制备Hb Ps。为建立Hb Ps的制备技术,本研究探讨了双乳法制备中乳化剂、有机相/水相的比例以及有机溶剂的种类对Hb Ps的粒径大小、粒径分布和包封率等理化性质的影响。根据Hb Ps可见光谱中Soret带的特征光谱,筛选出乙酸乙酯为有机溶剂能保持Hb在制备过程中不被氧化。多聚物浓度为20 mg/ml,Hb浓度为120 mg/ml,乳化剂PVA与F68比例为7:3时,制备的Hb Ps粒径大小为196.3 nm,粒径分布均一。通过Hb Ps的可见光谱、傅里叶变换红外光谱和圆二色谱图证实了上述条件制备Hb Ps对Hb的结构和功能无明显影响。通过测定Hb Ps的释氧曲线,证实了Hb Ps具有携氧-释氧功能。优选条件下制备的Hb Ps悬液在37oC放置7天,粒径维持在200 nm左右,Hb累积释放率为1.78±0.09%,在4oC保存42天,Hb累积释放率维持在0.50±0.01%,证实了Hb Ps具有良好的稳定性。二、Hb Ps的血液相容性及有效性评估。鉴于血液代用品用于静脉注射且临床使用输注量大,本研究初步评估Hb Ps血液相容性和有效性。通过黏度测定、红细胞聚集试验、凝血试验和溶血试验初步评价Hb Ps对血液成分(血浆、血小板和红细胞等)的影响。结果表明Hb Ps具有与全血相似的黏度特性,根据Hb Ps与离体人血直接接触后的血栓弹力图,证实了Hb Ps不引起凝血功能变化,且Hb Ps与红细胞孵育后无明显溶血作用,不会引起红细胞聚集,上述结果初步证实Hb Ps具有良好的血液相容性。将雄性Bal B/c小鼠随机分为NS组(生理盐水组)、RBC组(悬浮红细胞组)和Hb Ps组,通过建立小鼠控制性失血模型,监测动物在失血前、失血后和输液后的血压变化和治疗后的血气结果,评价Hb Ps对控制性失血小鼠的救治效果。结果表明Hb Ps在治疗控制性失血小鼠过程中能够维持平均动脉压,改善混合静脉氧分压。三、磁性Hb Ps及其靶向性研究。针对局部缺氧疾病靶向供氧需求,为提高Hb Ps生物利用率,以Hb Ps为基础包裹Fe2O3磁流体赋予Hb Ps磁靶向性能,制备Mag-Hb Ps(Magnetic hemoglobin loaded nanoparticles,Mag-Hb Ps)。根据透射电镜图、可见光谱图、圆二色谱图和释氧曲线,说明Mag-Hb Ps为规则球形,且Fe2O3磁流体对Hb结构和功能无明显影响。通过测定磁滞回线和体外磁响应实验,证实了Mag-Hb Ps具有超顺磁性和良好的磁响应性。在流动装置中考察了流速对Mag-Hb Ps磁靶向作用,随着流速降低Mag-Hb Ps磁靶向聚集明显,去除磁场后Mag-Hb Ps聚集体随流体剪应力作用消失。根据溶血试验和凝血试验的研究结果证实了Mag-Hb Ps的血液相容性良好。在Mag-Hb Ps中加入荧光标记Di R,利用小鼠活体荧光成像技术,在磁场作用下示踪Mag-Hb Ps分布情况,证实了Mag-Hb Ps的体内磁靶向作用。综上所述,本研究证实了m PEG-PLGA可以用于纳米微囊型HBOCs的制备,该品种HBOCs形态规则,粒径均一,稳定性高,制备过程能够维持Hb结构和功能,血液相容性良好,可以恢复组织氧供,为该类HBOCs的研究提供实验基础。通过在Hb Ps制备过程中加入磁流体制备具有磁靶向功能的Mag-Hb Ps,初步建立了靶向HBOCs关键技术,为拓宽血液代用品临床适用性提供支撑。
【图文】：

微量 Hb 测定试剂盒（博迈德公司）其他试剂均为国产分析纯。1.3 方法1.3.1 Hb 溶液的制备将取自鲁西黄牛的新鲜血液离心，获得红细胞，洗涤溶胀使红细胞膜破裂得到的 Hb 溶液，将 Hb 溶液微滤和超过滤，再通过阴离子交换层析柱纯化，制备高纯度 Hb 溶液，经 SDS-PAGE 测定 Hb 溶液纯度高，经血气分析仪测定，Hb总浓度为 25.2 g/dL，HbO2含量为 97.4 %，MetHb 含量为 2.6 %。MetHb 溶液的制备[62]：将 1.4 mg/ml K3Fe(CN)6加入 Hb 溶液中混合，通过血气分析仪测定 MetHb 含量大于 90%，即为 MetHb 溶液。1.3.2 HbPs 的制备PEG-PLGA 包裹 Hb 制备 HbPs 的过程如图 1-1 所示。

图 1-2 OxyHb 和 MetHb 在 350-650nm 处的特征光谱图图 1-3 所示为 7 组 HbPs 的特征光谱，在 Soret 带和 Q 带出现三个特征峰，主要表现为 Hb 的特征光谱。对比 OxyHb 和 MetHb 的特征光谱图，HbP2 组的Soret 带特征峰位在 412 nm，主要反映了 OxyHb 的光谱特征，HbP1、HbP3、HbP4HbP5、HbP6 和 HbP7 组的 Soret 带特征峰位在 405 nm，主要反映了 MetHb 的光谱特征，说明在 HbP1、HbP3、HbP4、HbP5、HbP6 和 HbP7 组中 Hb 被氧化，在 HbP2 组条件下，即用乙酸乙酯作为有机溶剂制备 HbP 时 Hb 不易被氧化。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R91

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本文编号：2541241