水蛭肽的分离纯化及其抑制巨噬细胞迁移的机制研究

发布时间：2019-10-03 01:47

【摘要】：当前,心脑血管疾病已经成为全球范围内致死率极高的一类疾病。其中,动脉粥样硬化被认为是多种心脑血管疾病的病理基础,发病原因复杂,目前缺乏针对性治疗方法。现代研究表明,炎症抑制是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)治疗的新道路。在免疫系统中,巨噬细胞是参与AS的首要细胞,并在AS的发生发展中发挥重要作用,若可以抑制巨噬细胞向AS发病部位的迁移,就可以在对免疫系统影响较小的情况下实现对AS的早期防治,延缓AS的病情发展。水蛭是传统中药,具有逐恶血、淤血,破血消积聚的作用,临床上主要用于心脑血管疾病的预后。本实验室前期研究证实水蛭酶解物能减少载脂蛋白E(ApolipoproteinE,ApoE)基因敲除小鼠体内AS斑块处巨噬细胞数量,对AS的形成和发展具有显著的抑制作用。在此基础上,由于巨噬细胞向内皮下层的迁移活动在AS病情发展过程中起到关键作用,本课题拟从水蛭中提取、分离纯化得到一个具有抑制巨噬细胞迁移活性的水蛭肽,并对其机制进行探究。主要研究内容如下:1.活性追踪下通过离子交换柱层析和凝胶柱层析分离纯化得到水蛭肽HP以LPS诱导小鼠Raw264.7巨噬细胞产生迁移,借助transwell小室共同构建细胞迁移模型。水蛭经过初步酶解等处理后得到水蛭酶解物HE,在使用tranwell小室法进行活性追踪的基础上,经过Q Sepharose强碱性阴离子交换柱层析得到5个峰组分,检测选取其中具有抑制迁移活性的HE3进行Superdex 30凝胶柱层析得到HE31,接下来使用Superdex Peptide凝胶柱层析初步得到水蛭肽HP0,经过Sephadex G10凝胶柱层析脱盐后得到水蛭肽HP,经过transwell小室检测和划痕实验,均表明其具有抑制LPS诱导的小鼠Raw264.7巨噬细胞迁移的活性。2.HP通过影响MEKK4和ASK2的转录发挥抑制巨噬细胞迁移的活性将HP分别与p38 MAPK、JNK、ERK、NF-κB和Src的抑制剂合用,通过transwell小室法检测巨噬细胞迁移活性以确定HP的活性机制。结果显示,与单独使用抑制剂相比,当HP分别与p38MAPK、JNK半数抑制剂合用时,并未出现抑制迁移效果的叠加,而HP与Src、NF-κB和ERK抑制剂合用时,抑制效应有所加强,这说明HP抑制LPS诱导巨噬细胞迁移的作用可能与p38 MAPK、JNK有关,而与ERK、NF-κB和Src无关。由于p38 MAPK和JNK同属于MAPK通路中的激酶,使用PCR对p38和JNK上游激酶MKK4、MLK3、MEKK3/4、ASK1/2进行转录水平的检测,结果显示,HP影响MEKK4和ASK2的转录,可能通过此方式调节各激酶水平来抑制巨噬细胞迁移活性,从而解释了宏观实验表现出的抑制迁移活性。综上所述,本课题首次从宽体金线蛭中分离纯化得到一个水蛭肽HP,证实它通过影响MAPK通路中MEKK4和ASK2的转录,进而影响下游p38 MAPK和JNK的作用,从而一定程度上抑制巨噬细胞迁移。在对免疫细胞影响尽量小的情况下实现对AS的早期预防,延缓AS病情发展,这对AS的防治具有重要的现实意义,为AS早期防治提供治疗新思路和新策略,同时对水蛭的进一步开发利用具有重要的理论和现实意义。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R945;R96

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