法舒地尔对表达于HEK293细胞的Kv7.4钾离子通道调节作用与机制的研究

发布时间：2019-10-03 03:11

【摘要】：目的:Kv7(Kv7.1-7.5)电压门控型钾通道家族由KCNQ基因编码,在调节神经元兴奋性(Kv7.2-Kv7.5)及心肌动作电位(Kv7.1)方面发挥着重要作用。普遍认为Kv7.2和Kv7.3通道组成的异四聚体构成了神经元M电流的分子学基础,参与调解多种神经元的兴奋性。近来,研究发现Kv7.4、Kv7.5通道在多种血管平滑肌细胞高表达,并参与调解血管的张力。而Kv7的调节剂可影响平滑肌细胞的膜电位及血管张力。还有研究显示,在血管平滑肌细胞,Kv7.4/Kv7.5是以异四聚体的形式存在的。所以神经细胞(Kv7.2/Kv7.3)与血管平滑肌细胞(Kv7.4/Kv7.5)Kv7钾通道亚型表达的不同,为药物的选择性作用提供基础。非选择性Kv7钾离子通道调节剂在临床中可能产生一定的副作用,例如第一个作为Kv7开放剂上市的药物瑞替加滨(retigabine,RTG),它在治疗癫痫的同时,被发现有引发尿潴留的副作用,这是因为Kv7开放剂可激活膀胱平滑肌上表达的Kv7钾通道所致。大多数已报道的Kv7调节剂对Kv7家族的各亚型没有选择性,尤其是对Kv7.2-Kv7.4。例如,瑞替加滨和氟吡汀(flupirtine)可以激活Kv7.2~7.5,但对Kv7.1无显著作用。所以,Kv7亚型选择性开放剂,或至少是对神经及血管上的Kv7钾通道具有亚型选择性的开放剂,对临床疾病的治疗具有重要意义。法舒地尔(fasudil),作为RhoA/Rho激酶(ROCK)抑制剂,在临床上用于脑血管痉挛性疾病及脑卒中后认知障碍性疾病的治疗,并且还被认为具有抗心绞痛的作用。在我们实验室前期的研究中发现法舒地尔可以选择性激活Kv7.4/Kv7.5通道,但对Kv7.2/Kv7.3通道无显著作用。本研究将探讨法舒地尔激活Kv7.4通道的分子机制问题。方法:利用电生理穿孔膜片钳技术,同源建模与分子对接技术及定向点突变技术探讨法舒地尔对Kv7.4钾离子通道的作用机制。结果:1法舒地尔对表达于HEK293细胞的Kv7钾离子通道电流的选择性调节作用。法舒地尔选择性激活表达于HEK293细胞的Kv7.4和Kv7.4/7.5通道,但对Kv7.1/KCNE1,Kv7.2及Kv7.2/7.3无显著影响。2利用同源建模及分子对接实验寻找法舒地尔与Kv7.4钾离子通道的作用位点。分子对接实验提示的Ile308可能为法舒地尔激活Kv7.4钾离子通道的关键位点。3构建Kv7.4(S6)钾离子通道突变体。利用定向点突变技术成功构建Kv7.4突变体,分别为:Kv7.4(I308V)、Kv7.4(L306I)、Kv7.4(L306I/I308V)、Kv7.4(G302T/A304T)。4利用膜片钳技术观察fasudil对Kv7.4(S6)钾离子通道突变体的作用。法舒地尔(30μM)可以增大Kv7.4(G302T/A304T)电流,增大程度与Kv7.4 wildtype没有区别。然而Kv7.4(G302T/A304T)对RTG(10μM)的敏感性明显降低了。而Kv7.4(I308V)、Kv7.4(L306I)、Kv7.4(L306I/I308V)对法舒地尔的敏感性显著下降了,而对瑞替加滨的反应与Kv7.4 wildtype没有区别。以上结果显示,S6区的Ile308和Leu306为法舒地尔调节Kv7.4的关键位点。5构建Kv7.4(S5-Pore)钾离子通道突变体。利用定向点突变技术对Kv7.4的S5-Pore区的6个位点进行了突变,成功构建了5个Kv7.4突变体,分别为:Kv7.4(W242L),Kv7.4(V248C),Kv7.4(F251L),Kv7.4(D262G/A263E),Kv7.4(T278L)。结论:我们的结果显示S6区的Ile308及Leu306可能为法舒地尔选择性激活Kv7.4通道的关键位点。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R96

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本文编号：2545240