无细胞蛋白合成体系实现胰岛素原可溶性表达
发布时间：2019-10-13 21:28
【摘要】：胰岛素原(Proinsulin,Pins)是胰岛素的合成前体。在大肠杆菌表达系统中,其一般以包涵体的形式存在,需要经过变性复性等后续加工过程才能得到有活性的胰岛素。而无细胞蛋白合成体系(Cell-free protein synthesis,CFPS)作为一种新型体外蛋白合成手段,突破了细胞的生理限制,已成功应用于多种重组蛋白药物的生产。为了探索胰岛素合成的新方法以满足其在新型给药途径研发中的需求,本研究运用CFPS体系进行胰岛素原的可溶性表达。通过将胰岛素原与荧光蛋白进行融合来增加其可溶性,成功在CFPS体系中表达了胰岛素原融合蛋白。最后使用Western blotting对融合红色荧光蛋白的胰岛素原(Pins-mCherry)进行鉴定,利用酶标仪对融合绿色荧光蛋白的胰岛素原(Pins-eGFP)在上清中的表达进行定量分析,结果表明Pins-eGFP部分可溶,其表达量为(12.28±3.45)μg/m L。本研究首次实现了融合胰岛素原在CFPS系统中的可溶性表达,其融合荧光蛋白的策略显著提升了胰岛素原的可溶性,该结果为探究胰岛素合成新方法及开发基于CFPS系统的新型胰岛素给药途径奠定了基础。
【图文】：
胡元等/无细胞蛋白合成体系实现胰岛素原可溶性表达：010-64807509：cjb@im.ac.cn471对融合蛋白徻行切从而实现成熟胰岛在CFPS系中的合成。在需要时，为了于储存和运输，可以这些组分分制成冻干粉，需要时通过加入水起始反应即可获得胰岛。图1E.coli生产胰岛素流程图及CFPS合成胰岛素的示意图(改编自文献[16])。(A)E.coli生产胰岛素流程图。(B)新型CFPS合成胰岛素实验设计。Fig.1TheoverallprocessofinsulinproductioninE.coliandtheschematicviewofCFPSinsulinproduction[16].(A)TheprocessofproducinginsulininE.coli.(B)ThedesignofCFPSbasedinsulinproduction.2.2质粒构建达胰岛原的重组质粒及融合荧光蛋白的胰岛原达质粒的设计如图2所示。胰岛原基因QJ隆至载pET-28a(+)获得重组质粒pYH1，经NdeⅠ和HindⅢ双酶切验证，，获得产物长度为268bp，与理论长度一致(图3)。为了实现胰岛原的可溶性达，构建了融合红色荧光蛋白(mCherry)的胰岛原重组质粒pYH2，通过PCR分扩增mCherry基因片段和重组质粒pYH1，获得产物长度为778bp和5535bp，结果与预期符。由于pYH2载上有2个NcoⅠ酶切点，使用NcoⅠ单酶切验证重组质粒，获得2个片段，长度分为5433bp和780bp，与理论长度符，证明重组质粒pYH2构建成功(图4)。构建编码融合绿色荧光蛋白(eGFP)与胰岛原融合基因重组质粒pYH3，PCR分扩增eGFP基因片段和重组质粒pYH1，获得产物长度为787bp和5535bp，结果与预期长度符。
ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechMarch25,2017Vol.33No.3http://journals.im.ac.cn/cjbcn472以NcoⅠ和ClaⅠ双酶切验证重组质粒，获得2个片段，长度分为3819bp和2403bp(图5)，证明重组质粒pYH3构建成功。同时在pYH2和pYH3质粒中胰岛原与荧光蛋白之间均加入了氨基酸序列为PSCSSPSP的连以融合对蛋白折的影响。图2本研究所构建的质粒示意图。(A)表达胰岛素原的重组质粒pYH1的构建。(B)融合红色荧光蛋白的胰岛素原重组质粒pYH2的构建。(C)融合绿色荧光蛋白的胰岛素原重组质粒pYH3的构建。Fig.2Schematicviewofconstructedrecombinantplasmids.(A)ConstructionofproinsulinexpressionplasmidpYH1.(B)ConstructionofrecombinantplasmidpYH2forexpressionofmCherry-proinsulinchimericprotein.(C)ConstructionofrecombinantplasmidpYH3forexpressionofeGFP-proinsulinchimericprotein.图3pins基因的PCR扩增及质粒pYH1的酶切验证结果。(A)PCR扩增胰岛素原基因(pins)。(B)表达胰岛素原的重组质粒pYH1的双酶切验证。Fig.3PCRamplificationresultofpinsandconfirmationofpYH1.(A)PCRamplificationofpinsgene.M:DL2000DNAmarker;lane1:PCRproductofpinsgene.(B)ConfirmationofrecombinantplasmidpYH1byNdeⅠandHindⅢdoubledigestion.M:DL2000DNAmarker;lane1:productsfromrecombinantplasmiddoubledigestedbyNdeⅠandHindⅢ.2.3CFPS表达eGFP的紫外透照仪检测为确定本次构建的CFPS系能合成蛋白质，在CFPS系中加入编码eGFP基因的质粒，用CFPS合成eGFP，采用外透照仪使用365nm波长徻行步检测。结果如图6所示，证明构建的CFPS系能成功达eGFP蛋白，可用于后续蛋白质的外合成。2.4CFPS表达胰岛素原的Westernblotting分析在证明CFPS系
【作者单位】： 武汉大学中南医院内分泌科;武汉大学药学院组合生物合成与新药S蜗纸逃恐氐闶笛槭
本文编号：2548902
【图文】：
胡元等/无细胞蛋白合成体系实现胰岛素原可溶性表达：010-64807509：cjb@im.ac.cn471对融合蛋白徻行切从而实现成熟胰岛在CFPS系中的合成。在需要时，为了于储存和运输，可以这些组分分制成冻干粉，需要时通过加入水起始反应即可获得胰岛。图1E.coli生产胰岛素流程图及CFPS合成胰岛素的示意图(改编自文献[16])。(A)E.coli生产胰岛素流程图。(B)新型CFPS合成胰岛素实验设计。Fig.1TheoverallprocessofinsulinproductioninE.coliandtheschematicviewofCFPSinsulinproduction[16].(A)TheprocessofproducinginsulininE.coli.(B)ThedesignofCFPSbasedinsulinproduction.2.2质粒构建达胰岛原的重组质粒及融合荧光蛋白的胰岛原达质粒的设计如图2所示。胰岛原基因QJ隆至载pET-28a(+)获得重组质粒pYH1，经NdeⅠ和HindⅢ双酶切验证，，获得产物长度为268bp，与理论长度一致(图3)。为了实现胰岛原的可溶性达，构建了融合红色荧光蛋白(mCherry)的胰岛原重组质粒pYH2，通过PCR分扩增mCherry基因片段和重组质粒pYH1，获得产物长度为778bp和5535bp，结果与预期符。由于pYH2载上有2个NcoⅠ酶切点，使用NcoⅠ单酶切验证重组质粒，获得2个片段，长度分为5433bp和780bp，与理论长度符，证明重组质粒pYH2构建成功(图4)。构建编码融合绿色荧光蛋白(eGFP)与胰岛原融合基因重组质粒pYH3，PCR分扩增eGFP基因片段和重组质粒pYH1，获得产物长度为787bp和5535bp，结果与预期长度符。
ISSN1000-3061CN11-1998/QChinJBiotechMarch25,2017Vol.33No.3http://journals.im.ac.cn/cjbcn472以NcoⅠ和ClaⅠ双酶切验证重组质粒，获得2个片段，长度分为3819bp和2403bp(图5)，证明重组质粒pYH3构建成功。同时在pYH2和pYH3质粒中胰岛原与荧光蛋白之间均加入了氨基酸序列为PSCSSPSP的连以融合对蛋白折的影响。图2本研究所构建的质粒示意图。(A)表达胰岛素原的重组质粒pYH1的构建。(B)融合红色荧光蛋白的胰岛素原重组质粒pYH2的构建。(C)融合绿色荧光蛋白的胰岛素原重组质粒pYH3的构建。Fig.2Schematicviewofconstructedrecombinantplasmids.(A)ConstructionofproinsulinexpressionplasmidpYH1.(B)ConstructionofrecombinantplasmidpYH2forexpressionofmCherry-proinsulinchimericprotein.(C)ConstructionofrecombinantplasmidpYH3forexpressionofeGFP-proinsulinchimericprotein.图3pins基因的PCR扩增及质粒pYH1的酶切验证结果。(A)PCR扩增胰岛素原基因(pins)。(B)表达胰岛素原的重组质粒pYH1的双酶切验证。Fig.3PCRamplificationresultofpinsandconfirmationofpYH1.(A)PCRamplificationofpinsgene.M:DL2000DNAmarker;lane1:PCRproductofpinsgene.(B)ConfirmationofrecombinantplasmidpYH1byNdeⅠandHindⅢdoubledigestion.M:DL2000DNAmarker;lane1:productsfromrecombinantplasmiddoubledigestedbyNdeⅠandHindⅢ.2.3CFPS表达eGFP的紫外透照仪检测为确定本次构建的CFPS系能合成蛋白质，在CFPS系中加入编码eGFP基因的质粒，用CFPS合成eGFP，采用外透照仪使用365nm波长徻行步检测。结果如图6所示，证明构建的CFPS系能成功达eGFP蛋白，可用于后续蛋白质的外合成。2.4CFPS表达胰岛素原的Westernblotting分析在证明CFPS系
【作者单位】： 武汉大学中南医院内分泌科;武汉大学药学院组合生物合成与新药S蜗纸逃恐氐闶笛槭
本文编号：2548902
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