褪黑素对大鼠酒精性脂肪肝的保护作用及其对AMPK活性的调节

发布时间：2019-10-24 07:29

【摘要】：与其受体有关。方法：采用酒精灌胃配合高脂饮食,制备大鼠脂肪肝模型,造模的同时灌胃褪黑素预防给药。6周末取血,分离血清,试剂盒检测谷草转氨酶(AST),谷丙转氨酶(ALT),甘油三酯(TG),低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C);肝匀浆检测肝脏SOD活性和MDA、TG水平；制备石蜡切片进行组织病理学的检查；Western blot检测大鼠肝脏AMPK-α及磷酸化AMPK-α的表达。同时采用酒精联合油酸刺激HepG2细胞建立体外肝细胞脂质蓄积模型,油红O(ORO)染色对体外模型进行评价；试剂盒检测细胞内TG和cAMP水平；Westernblot检测大鼠肝脏AMPK-α,磷酸化AMPK-α及褪黑素受体1(MT1R)的蛋白的表达。结果：1.褪黑素对大鼠AFL的保护作用本研究采用酒精联合高脂饮食造模,造模的同时灌胃给予褪黑素(10、20、40 mg/kg),阳性药组给予还原型谷胱甘肽(GSH,180 mg/kg),腹腔注射给药,共给药6周。病理学检查结果显示,褪黑素和GSH给药均可显著改善肝脏的脂肪变性程度。与正常组相比,模型组大鼠体重明显下降,褪黑素用药后无明显改变,但褪黑素低、中、高剂量组均可不同程度的降低大鼠肝脏指数。生物学指标检测表明,褪黑素可显著降低血清ALT、AST的水平。以上结果提示,褪黑素对AFL大鼠有明显的防治作用。2.褪黑素对AFL大鼠脂质代谢的影响与正常组相比,酒精和高脂饮食联合刺激导致大鼠血清TG、LDL-C和肝脏TG的水平显著上升,血清HLD-C的水平显著下降。褪黑素20mg/kg或40 mg/kg剂量给药后可显著降低血清TG、LDL-C和肝脏TG的水平,升高血清HLD-C的水平。提示褪黑素对大鼠AFL的肝脏保护作用可能与其调节脂质代谢,减轻脂质沉积有关。3.褪黑素对AFL大鼠肝脏氧化代谢的影响与正常组相比,模型组大鼠肝匀浆中SOD的活性显著下降,脂质过氧化产物MDA的水平显著增加。表明,酒精和高脂饮食联合刺激导致模型组大鼠体内氧化和抗氧化失衡,活性氧(ROS)及自由基产生增加,启动脂质过氧化反应。褪黑素给药后,肝脏SOD的活性显著增加,MDA的水平显著下降。提示,褪黑素对大鼠AFL的保护作用可能与其抗氧化应激和减轻脂质过氧化作用有关。4.褪黑素对AFL大鼠肝脏AMPK蛋白表达的影响腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)是一类能被AMP激活的蛋白激酶,在脂肪代谢的调节中发挥着重要的作用。与正常组相比,模型大鼠肝脏磷酸化的AMPK-α水平显著降低,褪黑素给药后磷酸化AMPK-α蛋白的表达增加。AMPK-α的磷酸化形式为其活化形式,即褪黑素用药后增加肝脏AMPK-α的活性。以上结果提示,褪黑素调节脂质代谢的作用可能与增强AMPK-α的活性有关。5.褪黑素对酒精联合油酸刺激的HepG2细胞脂质代谢的影响为进一步探讨褪黑素如何调节AMPK-α活性,我们采用酒精联合油酸刺激HepG2细胞建立了体外肝细胞脂肪蓄积模型。油红染色结果显示,正常组细胞呈铺路石样排列,细胞内少见红色脂滴,酒精联合油酸刺激组(O+A组)细胞内红色脂滴较多,部分细胞的脂滴围绕细胞膜内侧呈环状排列,褪黑素用药后脂滴减少。同时油红染色的定量结果也同样显示,褪黑素10-8、10-7、10-6、10-5M剂量组均可不同程度降低细胞内的脂滴。TG的测定结果显示,与正常组相比,O+A组细胞内TG的含量显著增加,褪黑素10-8、10-7、10-6、10-5 M剂量均可不同程度降低细胞内TG的含量。以上结果表明,我们用乙醇和油酸联合刺激成功的构建了体外肝脏脂肪蓄积模型,而褪黑素对酒精联合油酸刺激的体外肝细胞脂肪蓄积具有减轻作用。6.褪黑素对酒精联合油酸刺激的HepG2细胞内AMPK的影响与正常组相比,油酸+乙醇(O+A)组磷酸化AMPK-α的表达显著降低,褪黑素用药后磷酸化AMPK-α水平显著增加,而同时给予褪黑素的同时给予褪黑素受体竞争性拮抗剂Luzindole组磷酸化AMPK-α的蛋白水平与褪黑素单独用药组相比显著降低。提示褪黑素对HepG2细胞内AMPK-α的活性调节作用可能是由其受体介导的。7.褪黑素对酒精联合油酸刺激的HepG2细胞内MTlR/cAMP的影响与正常组相比,O+A组MT1R的蛋白表达显著降低,褪黑素及褪黑素加Luzindole显著增加了MT1R的蛋白表达。cAMP的检测结果显示,乙醇和油酸联合刺激使HepG2细胞内cAMP水平显著增加,褪黑素10-7、10-6、10-5 M给药均可显著降低HepG2细胞内cAMP的水平,同时在褪黑素10-6给药基础上给予Luzindole可逆转褪黑素的降低HepG2细胞内cAMP的水平的作用。结果提示,褪黑素对HepG2细胞内AMPK-α的活性调节作用可能与其对MT1R/cAMP信号通路的调节作用有关。结论：1.褪黑素能够从病理上改善大鼠肝脏脂质蓄积,并能降低血清ALT、AST、TG、 LDL-C和肝脏TG、MDA的水平,增加血清HLD-C水平和肝脏SOD的活性,对大鼠AFL具有保护作用。2.褪黑素可增加AFL大鼠肝脏和酒精和油酸联合诱导的HepG2细胞磷酸化AMPK-α的蛋白表达,并发现褪黑素对HepG2细胞内AMPK-α的活性调节作用可能与其对MT1R/cAMP信号通路的调节作用有关。
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３．６，

本文编号：2552447