辛伐他汀对原代人脐静脉内皮细胞DDAH1不同转录本表达的影响及机制研究

发布时间：2019-11-03 20:19

【摘要】：目的： ADMA是心血管疾病的风险因素,其主要代谢酶DDAHA被认为是心血管疾病治疗的重要靶点。本课题组的前期研究发现人类DDAH1存在3个转录本,但只有其中DDAH1-V1与ADMA代谢相关。本文旨在研究辛伐他汀对DDAH1的三个不同转录mRNA表达的影响及其机制,为探讨DDAH1不同转录本在辛伐他汀反应性及不同转录本的功能奠定基础。 方法： (1)Transwell小室实验测定辛伐他汀对ADMA处理的脐静脉内皮细胞迁移的影响：细胞分为DMSO(对照)组、ADMA(3μM)处理组、ADMA(3μM)+辛伐他汀(1μM)处理组和辛伐他汀(1μM)处理组。细胞应用DMSO(对照组)或ADMA(3μM)处理24h,ADMA(3μM)+辛伐他汀(1μM)处理组和辛伐他汀(1μM)处理组先用1μM辛伐他汀预处理6h,将细胞转移至Transwell小室上室,24h后测定小室对侧迁移的细胞数目,以评估内皮细胞迁移能力。 (2)观察辛伐他汀对原代人脐静脉内皮细胞DDAH1转录本表达的影响：原代培养的脐静脉内皮细胞分别应用DMSO(溶剂对照组)或低、中、高浓度(0.2μM、1μM、2μM)的辛伐他汀处理12h和24h,提取总RNA和总蛋白,采用Real-time PCR的方法检测DDAH1的三个转录本mRNA表达,western-blot检测DDAHl-V1蛋白表达。 (3)观察辛伐他汀对人脐静脉内皮细胞DDAHI转录本mRNA稳定型的影响：人类脐静脉内皮细胞株分别加用(处理组)或不加(对照组)辛伐他汀(1μM、2μM)预处理2h后,加入放线菌素D(ActD,2.5μg/ml)进行处理,并在加入ActD后Oh、1h、2h、4h、8h和12h收集细胞,提取总RNA,采用Real-time PCR法检测DDAHI的三个转录本mRNA的表达。 结果： (1)与对照组相比,3μM ADMA处理可显著促进内皮细胞迁移(1.30±0.30vs1±0.00,P=0.012),中浓度的辛伐他汀单独处理对内皮细胞迁移无显著影响。与ADMA处理组相比较,中浓度辛伐他汀+ADMA组细胞迁移比显著下降(0.94±0.086vs1.30±0.30,P=0.011)。 (2)与DMSO组相比,低、中、高浓度的辛伐他汀对DDAH1转录本1(DDAH1-V1)mRNA表达均无显著影响；中、高浓度的辛伐他汀呈浓度依赖性地下调DDAHI转本2(DDAHI-V2)mRNA表达(0.52±0.24vs0.89±0.23,P=0.044和0.38±0.19vs0.89±0.23,P=0.0093)和转录本3(DDAH1-V3)的mRNA表达(0.59±0.19vs0.86±0.05,P=0.028和0.40±0.15vs0.86±0.05,P=0.0013)。 (3)与DMSO相比,低、中、高三个浓度的辛伐他汀处理12h呈浓度依赖性地上调内皮细胞内DDAH1-V1蛋白表达(低浓度：1.35±0.16vs1±0.00,P=0.03；中浓度：1.90±0.29vs1±0.00,P=0.00014；高浓度：1.95±0.04vs1±0.00,P=0.0001)。低、中浓度辛伐他汀有上调DDAH1蛋白表达的趋势,但未达到显著地统计学意义；高浓度辛伐他汀处理24h可显著上调DDAHl-V1蛋白表达(2.11±0.55vs1±0.00,P=0.0097)。 (4)与DMSO组相应时间点相比较,2.5μg/ml ActD在1-12h内具有升高DDAHI-V1mRNA△CT(CTDDAH1转录本-CTGAPDH)的趋势,且在处理后1h时达到统计学差异(5.63±0.64vs4.64±0.37,P=0.011)。与ActD相应时间点相比,1μM Sim+ActD处理组1-4hDDlAH1-V1mRNA△CT值出现降低的趋势,但仅1h和2h出现显著下降(1h:4.66±0.27vs5.63±O.64,P=0.0085:2h:3.53±O.60vs5.89±0.15,P=0.021)；2μM Sim+ActD处理组1-8h DDAH1-V1mRNA△CT值有下降的趋势,仅1h时具有显著的差异(4.36±0.17vs5.63±0.64,P=0.0040)。 (5)与DMSO相比,ActD在8-12h有升高DDAH1-V2mRNA△CT的趋势,且在8h达到显著地统计学差异(8.06±0.49vs7.21±0.15,p=0.012)；与ActD2.5μg/ml相比,Sim1μM+ActD和Sim2μM+ActD处理对DDAH1-V2mRNA的△CT值无显著影响。 (6)与DMSO相比,2.5μg/ml ActD处理2-12h DD4H1-V3mRNA的△CT有升高的趋势,但无显著地统计学差异。与ActD2.5μg/ml处理组相比,Sim1μM+ActD处理和Sim2μM+ActD处理对DDAH1-V3mRNA的△CT无显著影响。 结论： (1)病理生理浓度的ADMA可促进原代培养的HUVECs细胞迁移,该作用可被辛伐他汀所逆转。 (2)原代培养的HUVECs在辛伐他汀作用下,DDAH1-V2和DDAH1-V3mRNA表达显著下降,而DDAH1-V1mRNA的表达相对稳定,DDAH1-V1蛋白表达上调。 (3)辛伐他汀上调DDAH1-V1蛋白表达的机制可能与增加DDAH1-v1mRNA的稳定性有关。
【图文】：

移的作用不显著，与3 ADMA组相比较，ADMASim组细胞迁移数显著下降（尸=0.002)(见表8，，图1和图2)。表8. ADMA对原代人济静脉内皮细胞迁移的影响及辛伐他;丁的逆转作用（* iSD )Groups Relative cell migration rateDMSO (Control) 1±0.003^M ADMA 1.30 士 0.30*3 nM ADMA + 1 Sim 0.94±0.086#*l^M Sim 0.80±0.22注：DMSO: 0.02% DMSO;. ADMA3nM ; 3nMADMA 处理组；Sim l|iM: l|alVI 辛伐他、；丁处理组；Sim luM +3nMADMA: l(xM 辛伐他丁和 3nM ADMA 共同处理；*P<0.05，与 DMSO处理相比较；*V<0.01，与3nM ADMA组相对比；每组n=8。

A处理对原代人脐静脉内皮细胞迁移的影响及辛伐他；丁的作用。注：DMSMA 3uM: 3nM 的 ADMA+0.02% DMSO; Sim luM: 1 |uMI 辛伐他；丁ADMA3uM: 辛伐他打处理组和3nM的ADMA共同处理；*P<0.0较；Sim luM+ADMA3uM 与 ADMA3nM 对比，#*P<0.01;每组 n=8。他对原代人骄静脉内皮细胞不同转录本mRN的影响浓度辛伐他汀处理12h对细胞内DDAW三个转录本的mRNA考文献中辛伐他汀的处理浓度进行辛伐他汀浓度的确定，应用、和2WVI)辛伐他汀（Sim)处理第3代原代脐静脉内皮细，与空白对照组相比较，DMSO溶剂对照组DZX4///三个转录本
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

【共引文献】

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本文编号：2555255