寡聚精氨酸纳米复合物的构建和评价

发布时间：2019-11-12 12:00

【摘要】：目的:RNA干扰(RNA interference,RNAi)的发现,被认为是生物学中最重要的发现之一。许多类型的疾病,包括病毒感染、癌症等已被证实可作为RNAi治疗的潜在目标。在近十几年来,RNAi在基因功能和基因治疗方面的研究越来越受到人们的关注,逐渐发展成为一种较为成熟的技术。但是,裸露siRNA稳定性差,易被体内的核酸酶降解,且自身的性质,如分子量高、负电性、亲水性等阻碍了其跨膜转运,极大地限制了siRNA的进一步应用。因此如何高效地运输siRNA至靶细胞并有效的穿过细胞膜释放到细胞质中成为人们研究的热点。细胞穿膜肽是由5-30个氨基酸组成的阳性或两性的短肽,具有转染活性高,生物活性好,低毒性等优点,而且其自身不仅能够高效的穿过细胞膜进入细胞,也可以介导其他外源性的分子进入细胞,是目前快速发展的一种新型药物载体。最近,细胞穿膜肽用于siRNA的细胞递送已经逐渐成为人们研究的热点。但是作为siRNA的运输载体,细胞穿膜肽的摄取效率低,且不易从内涵体内逃出,极大地限制了细胞穿膜肽的应用。因此,为了提高siRNA摄取效率,需要对细胞穿膜肽进行修饰,使其能与siRNA更好地复合,使制剂更稳定,摄取效率大大提高。本文构建了寡聚精氨酸(R8)与siRNA的纳米复合物,经过硬脂酰化和聚乙二醇化分别合成了STR-R8和STR-R8-PEG两种不同的载体材料,制备了STR-R8/siRNA、STR-R8-PEG/siRNA和STR-R8-PEGn/siRNA三种不同的纳米复合物。通过粒径、电位、电泳行为等评价不同处方的纳米复合物,筛选出理化性质优良的处方。并以MCF-7、HT-1080和Hela细胞为模型,考察载体与细胞之间相互作用。方法:通过查阅文献及试验,确定了压缩材料STR-R8和STR-R8-PEG的合成和纯化方法。在室温条件下,将SA-NHS与CPP搅拌反应30 min,纯净水透析24 h,冷冻干燥后的产物即为STR-R8。在室温条件下,将STR-R8与m PEG2000-Mal避光反应24 h,纯净水透析24 h,冷冻干燥后的产物即为STR-R8-PEG。通过MS对该合成产物进行表征。通过参考文献和大量预试验,以siRNA为模型药物,筛选纳米复合物的处方。以制剂的粒径、电位和琼脂糖凝胶的电泳行为等为指标,考察制剂的理化性质,筛选出最佳的制剂处方。以MCF-7、HT-1080和Hela为细胞模型,通过流式细胞仪定量分析评价细胞摄取率,通过倒置荧光显微镜观察纳米复合物在细胞中的分布以及定位。结果:通过质谱结果分析,合成得到了STR-R8和STR-R8-PEG。此方法条件温和,方法简单快捷。通过纯化能够得到纯度较高的产物。以siRNA为模型药物,通过室温孵育的方法,能够简单快捷的制备siRNA纳米复合物。以粒径、电位和凝胶电泳行为为指标,得出STR-R8处方的粒径在200 nm以内,Pd I比较均匀,N/P值大于等于20时,能够很好的包裹siRNA;STR-R8-PEG处方粒径在300 nm左右,Pd I均匀,N/P值等于20时,仍不能将siRNA完全包裹;因此考虑将STR-R8和STR-R8-PEG两种载体材料按一定比例混合,制备复合载体材料STR-R8-PEGn。经过大量试验最终筛选出的最佳处方为N/P比均为20的STR-R8/siRNA和STR-R8-PEG20%/siRNA。通过流式细胞仪的结果可知:在MCF-7和HT-1080两种细胞中,与游离siRNA相比,STR-R8和STR-R8-PEG20%均能够大大地提高siRNA的细胞摄取率。且两种载体作用于MCF-7细胞后,其细胞摄取率均能够达到市售试剂的水平。对于HT-1080细胞,细胞摄取率呈现时间依赖性,即给药时间越长,细胞摄取率越大。但对于MCF-7细胞,在给药2 h后,细胞摄取率达到最大,之后随着时间的推移,细胞摄取率逐渐降低。通过倒置荧光显微镜可知:STR-R8和STR-R8-PEG20%均能够很好地介导siRNA进入细胞,并将siRNA定位在细胞质中。结论:STR-R8和STR-R8-PEG合成方法简单快捷,条件温和,产物中杂质较少,为接下来的试验奠定了基础。经过大量试验筛选的处方STR-R8/siRNA和STR-R8-PEG20%/siRNA粒径符合要求,且分布均匀,能够完全包载siRNA。通过流式细胞仪和倒置荧光显微镜的结果可得STR-R8和STR-R8-PEG20%两种载体材料能大大提高siRNA的摄取效率并且实现siRNA的细胞质释放。
【图文】：

STR-R8纯化前质谱结果

图 1-2 STR-R8 纯化后质谱结果Fig.1-2 Characterization of STR-R8 after dialysis in purified water with MS(m/z)
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R914

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本文编号：2559760