基于GSH敏感胶束对乳腺癌光动力疗法—化疗的基础研究

发布时间：2020-01-28 07:06

【摘要】：癌症已成为危害人类健康的重大疾病之一,其中乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤。乳腺癌传统的治疗方式主要是手术和放化疗。手术切除创伤大,易复发。化疗是全身治疗最有效的手段之一,但化疗药物对正常细胞呈现不同程度的损伤。阿霉素(DOX)是一种广谱抗肿瘤化疗药物,其作用机制是通过插入DNA链中阻断DNA合成。但DOX半衰期短,毒副作用大,易产生耐药性,其临床应用受到影响。光动力疗法(PDT)是一种高效治疗肿瘤的新型疗法。其策略是通过特定波长的光源激发肿瘤部位的光敏剂,在体内通过一系列光反应产生活性氧物种(ROS),进而和肿瘤细胞内的大分子发生光化学和光生物反应,诱导肿瘤细胞凋亡或坏死。PDT具有疗效明确、毒副作用低、无耐药性、可重复治疗等优势,美国FDA于1997年将其列入肿瘤治疗的基本疗法之一。但其激发光对组织穿透力弱,光敏剂水溶性差且在肿瘤部位蓄积量少,限制了PDT的临床应用。为提高抗肿瘤疗效,研究者们常将PDT与化疗联用,抑制术后肿瘤复发及转移。PDT与化疗具有不同的作用机制,且没有交叉毒性。但光敏剂水溶性低,生理条件下易聚集,化疗药物毒副作用大,影响了PDT与化疗的进一步应用。为增强光敏剂和化疗药物的靶向性,降低化疗药物毒性,多种纳米递药系统已应用于癌症治疗。其中,刺激响应型HPMA聚合物材料具有良好的水溶性和生物相容性,可通过EPR效应被动蓄积到肿瘤部位,并在较短时间内快速释放药物,已成为研究热点。迄今为止,一些HPMA聚合物前药研究已进入临床试验阶段。基于此,本文设计了一种GSH敏感的DOX前药型聚合物。旨在改善DOX和光敏剂二氢卟吩e6(Ce6)的水溶性,同时通过EPR效应增加药物在肿瘤部位的蓄积量,利用靶向胶束以及PDT联合化疗提高抗乳腺癌有效性。本文通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合反应合成具有GSH敏感的两亲性嵌段聚合物pHPMA-SS-DOX。利用体积排阻色谱法(SEC)对聚合物进行表征,用紫外可见分光光度计(UV-Vis)测定化学键合DOX的载药量。采用薄膜水化法制备DOX/Ce6共同载药胶束(CLM),通过纳米粒度及电位分析仪、透射电子显微镜(TEM)、荧光分光光度计(FL)、UV-Vis分别表征粒径、聚合物分散指数(PDI)、电位、形态、临界胶束浓度CMC、包封率、载药量及在冷藏条件下的稳定性。采用透析法考察CLM在不同释放介质中的体外释药行为。以9,10-二苯基蒽丙酸钠(ADPA)作为单线态氧(1O2)捕捉剂,检测CLM经660 nm激光照射后的1O2产率。以GSH过度表达的4T1小鼠乳腺癌细胞为细胞模型,通过激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)对细胞的摄取行为进行荧光成像,并用不同的内吞抑制剂考察细胞对胶束的内吞途径。以2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)作为荧光探针,检测光照后CLM对细胞内ROS水平的影响。通过CCK-8检测CLM对细胞的暗毒性及光毒性,并用流式细胞术定量检测细胞凋亡率。建立4T1小鼠乳腺癌皮下模型,检测不同时间点下CLM在体内的分布,评价其肿瘤靶向性,并以肿瘤体积生长、抑瘤率和小鼠体重变化为指标,考察DOX前药靶向胶束联合PDT的抗乳腺癌有效性。通过对心脏和肿瘤组织的病理学检查评价CLM对心脏的毒性及诱导肿瘤细胞坏死情况。结果显示,GSH敏感的DOX前药型聚合物被成功合成,DOX载药量约为5%。聚合物在水溶液中自组装形成胶束,CLM粒径为122.0?8.0 nm,PDI为0.149?0.03,Zeta电位值为-7.54?0.87 mV,TEM观察到的胶束呈分布均匀的球形。CMC为0.014 mg/mL。胶束对Ce6的包封率约为76.2?5.2%,载药量约为4.82?0.4%,在4℃冷藏条件下一周内具有良好的稳定性。CLM的体外释药行为呈GSH敏感性,经660 nm激光照射后具有良好的1O2产率。载药胶束增强了4T1细胞对药物的摄取,其主要以网格蛋白介导的内吞途径进入细胞。CLM进入细胞后,经激光照射后可显著提高细胞内的ROS水平。CLM在未光照条件下的IC50值为60.0?g/m L,光照0 min和10 min(0.3 W/cm2)后,细胞存活率分别为81.1?10.7%和25.1?1.3%。流式细胞术的结果表明,CLM联合PDT-化疗诱导的细胞凋亡率(55.2?5.3%)显著高于单独化疗的细胞凋亡率(23.1?2.1%)。4T1乳腺癌小鼠尾静脉给药后,体内组织分布结果显示,胶束促进了药物在肿瘤部位的蓄积,延长了药物的作用时间,给药36 h后药物蓄积最多。体内抗肿瘤结果表明,基于CLM的PDT联合化疗可以明显抑制肿瘤生长。病理学检查结果显示,CLM对心脏几乎无毒性,且能最大程度诱导肿瘤细胞的坏死。综上所述,本文成功合成了一种GSH敏感的DOX前药型聚合物,在水溶液中以较低浓度自组装形成胶束,可以提高难溶性药物的溶解度。载药胶束呈均匀分布的球形,粒径较小,包封率高,体外释药对GSH敏感。聚合物纳米胶束通过EPR效应增强了药物在肿瘤部位的分布,PDT联合化疗抗乳腺癌在体内外均展现了良好的有效性。该聚合物载药胶束有望成为一种安全有效的抗乳腺癌的靶向给药系统。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R914;R96

【参考文献】