活性卤酚化合物对血管内皮细胞EA.hy926中HO-1的诱导及其上游信号通路的调控作用

发布时间：2017-03-20 19:02

  本文关键词：活性卤酚化合物对血管内皮细胞EA.hy926中HO-1的诱导及其上游信号通路的调控作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:课题组前期通过系统结构优化获得了多个对过氧化氢(H2O2)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)具有显著保护活性的新型卤酚类化合物,其中2,4’,5’-三羟基-5,2’-二溴二苯甲酮(LM49)、4,5-二羟基2,3-二溴二苯甲酮(LM48)和3,4-二羟基-3’-氯二苯甲酮(LM46)的活性最高。同时该类化合物具有显著的抗大鼠动脉粥样硬化及心肌缺血再灌注损伤的保护作用,显示了重要的应用开发价值。但是,由于对其作用机制仍不十分清楚,极大地限制了此类化合物的进一步开发利用。本论文旨在以高活性卤酚化合物为小分子探针,探讨此类化合物保护血管内皮细胞损伤作用的调控机制;寻找作用靶点,为后续针对性设计合成高活性化合物和进一步开发利用等深入研究提供科学依据。方法:本实验首先采用Western blot证实10μM LM49、LM48和LM46对血红素加氧酶-1(HO-1)表达诱导作用;同时,MTT法考察HO-1特异性阻滞剂——Zn PP预处理后,LM49、LM48和LM46对细胞保护率的变化。利用流式细胞术及ELISA法证实LM49、LM48和LM46对H2O2损伤EA.hy926后的活性氧(ROS)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达水平影响;并且在Zn PP预处理后,化合物对ROS和TNF-α抑制作用的变化。进一步选取6个细胞保护活性不同的同类卤酚化合物1-[4-溴-2-(2-溴-4,5-二羟基苯甲酰)苄基]哌啶-4-羧酸(LM50);(2,3-二羟基-4,5-二氯-苯基)(呋喃-2-基)甲酮(LM51),4,5,2’-三羟基2,5’-二氯-二苯甲酮(LM52);2’,3,4-三羟基-2,5,5’-三氯-二苯甲酮(LM53);[2-(1H-苯并[d]咪唑-1-取代)甲基]-5-溴苯)(2-溴-4,5-二羟基苯基)甲酮(LM54);1-[4-溴-2-(2-溴-4,5-二羟基苯甲酰)苄基]哌嗪-4-乙酮(LM55)进一步验证其对HO-1的诱导作用与细胞保护活性。后续实验选择活性最高的LM49采用Western blot进一步研究LM49对HO-1、Nrf2诱导和激活p38、JNK、Erk1/2、AKT和PKC-δ磷酸化诱导活性;并且加入特异性阻断剂预处理后,考察LM49对HO-1诱导活性的变化。结果:10μM LM49、LM48和LM46对血红素加氧酶-1(HO-1)表达具有显著诱导作用,诱导活性依次为LM49LM48LM46,这与细胞保护活性的强弱存在一致性,即诱导HO-1活性高的化合物其细胞保护活性也相对较高。同时,Zn PP预处理后,LM49、LM48和LM46对细胞的保护率均显著降低。LM49、LM48和LM46还能够显著降低H2O2损伤EA.hy926后的ROS及TNF-α表达水平;并且在Zn PP预处理后,化合物对ROS和TNF-α的抑制作用也显著减弱。进一步验证6个不同程度细胞保护活性的同类卤酚化合物,结果显示其对HO-1的诱导作用与细胞保护活性强弱仍存在明确的一致性,这与前述研究结果一致。但是,涉及HO-1调控的具体机制仍不清楚。后续实验结果显示LM49对HO-1、Nrf2诱导和激活Erk1/2、AKT磷酸化具有显著量效关系,但是对p38、JNK磷酸化和PKC-δ表达无明显影响;分别加入PD98059(Erk特异性阻断剂)和Wortmannin(PI3K特异性阻断剂)预处理后,LM49对HO-1的诱导活性显著降低。结论:(1)HO-1为卤酚化合物抗氧化、发挥细胞保护活性的关键蛋白。LM49、LM48和LM46通过诱导HO-1表达,降低ROS水平和抑制TNF-α表达,最终发挥细胞保护活性;(2)高活性卤酚化合物LM49主要是通过Erk1/2和PI3K/AKT介导的Nrf2转录活化,进而调控HO-1表达。
【关键词】：卤酚化合物 EA.hy926 血红素加氧酶1(HO-1) 细胞外调节蛋白激酶(Erk1/2) 磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一部分 HO-1—卤酚化合物发挥内皮细胞EA.Hy926 保护活性的关键蛋白14-29
• 1 材料与方法15-19
• 1.1 主要仪器15
• 1.2 主要试剂15-16
• 1.3 细胞来源16
• 1.4 化合物来源16
• 1.5 实验方法16-18
• 1.6 统计分析18-19
• 2 结果19-26
• 2.1 药物毒性实验19
• 2.2 细胞保护活性实验19-21
• 2.3 化合物对EA.hy926 中HO-1 诱导作用21-24
• 2.4 化合物对H2O2损伤EA.hy926 后ROS和TNF-α 表达的影响24-26
• 3 讨论26-28
• 3.1 药物毒性实验26
• 3.2 细胞保护活性实验26
• 3.3 化合物对EA.hy926 中HO-1 诱导作用26-27
• 3.4 化合物对H2O2损伤EA.hy926 后ROS和TNF-α 表达的影响27-28
• 4 结论28-29
• 4.1 诱导HO-1 表达与细胞保护活性相关性28
• 4.2 诱导HO-1，抑制ROS和TNF-α 表达，发挥细胞抗氧化保护活性28-29
• 第二部分 高活性卤酚LM49 对内皮细胞EA.hy926 中HO-1 蛋白上游信号通路的调控作用29-41
• 1 材料与方法29-33
• 1.1 主要仪器29-30
• 1.2 主要试剂30
• 1.3 细胞来源30
• 1.4 化合物来源30-31
• 1.5 实验方法31-32
• 1.6 统计分析32-33
• 2 结果33-39
• 2.1 LM49 诱导EA.hy926 中HO-1 表达33-34
• 2.2 LM49 对H2O2损伤的EA.hy926 中ROS及TNF-α 表达的影响34-35
• 2.3 LM49 对胞核Nrf2 含量的影响35
• 2.4 LM49 对MAPK、PI3K/AKT及PKC通路磷酸化影响35-39
• 3 讨论39-40
• 3.1 LM49 诱导EA.hy926 中HO-1 表达39
• 3.2 LM49 对H2O2损伤的EA.hy926 中ROS及TNF-α 表达的影响39
• 3.3 LM49 对胞核Nrf2 含量的影响39
• 3.4 LM49 对MAPK、PI3K/AKT及PKC通路磷酸化影响39-40
• 4 结论40-41
• 4.1 LM49 诱导HO-1 和Nrf2 表达40
• 4.2 LM49 主要是通过Erk1/2 和PI3K/AKT介导的HO-1/Nrf2 转录活化40-41
• 参考文献41-48
• 综述48-62
• 参考文献55-62
• 致谢62-63
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果63-64
• 个人简历64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 史大永;李晓红;李敬;郭书举;苏华;范晓;;Antithrombotic effects of bromophenol,an alga-derived thrombin inhibitor[J];Chinese Journal of Oceanology and Limnology;2010年01期

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本文编号：258264