基于活性分子设计的小分子探针及生物学研究

发布时间：2020-03-12 13:15

【摘要】：活性小分子探针是靶标识别的重要工具,在新药靶标发现和靶蛋白特异性识别中具有重要意义。本论文设计合成了两类功能性小分子探针:光亲和探针和荧光探针。光亲和探针含有功能性的光亲和基团和纯化基团,能够在光照条件下特异性与靶标共价结合,并通过纯化基团对靶标进行分离和富集。荧光探针含有功能性的荧光基团,能够在分子水平上对靶标进行识别、定位。天然产物(-)-arctigenin及其类似物在L6骨骼肌细胞水平上表现出显著的促葡萄糖摄取活性,动物水平的评价表明具有明显的降糖效果。机制研究发现其是AMPK信号通路的激动剂,但直接作用靶标未知。对这类化合物的构效关系研究确定优势母核,并发现A环间位氨基上苄基取代的化合物保持了良好的促葡萄糖摄取活性。采用原位标记的策略,在苄基上进行了二吖丙啶类和二苯甲酮类光亲和基团的引入,通过多样性的结构改造,获得了活性保持的光亲和探针2P14(1.789@1.5μM),并进行了靶标垂钓的工作。利用P14与L6骨骼肌细胞共孵育,使其与靶蛋白有效结合;紫外光照激发光敏基团,使其与靶蛋白共价偶联;利用铜催化的Huisgen环化反应,在靶蛋白上引入生物素;采用链亲和素柱对靶蛋白进行富集浓缩;对浓缩的蛋白质样品进行SDS-PAGE凝胶分离纯化,并选取特异性条带进行质谱鉴定;数据分析处理获得了三个与能量代谢相关的蛋白P06576、E9PN89和P81605,进一步的工作还在进行中。同时为了对靶标进行细胞定位,设计合成了10个荧光探针,但是未获得活性探针。在探针2P14的靶标垂钓实验中,对实验条件进行了摸索和细节优化,建立了靶标垂钓实验的整体流程和条件优化的方法。在活性光亲和探针的设计中,合成了结构多样性的光亲和基团11种,利用光亲和基团库,快速获得了选择性抗肝癌Yhhu-258类化合物的高活性光亲和探针3P5(IC50=153 nM)。在活性荧光探针的合成中,发现了一类合成简便、结构新颖的BODIPY类荧光淬灭探针,对这类探针进行结构-荧光性质考察发现:1.苯胺是荧光淬灭必须的;2.苯胺上给电子基的取代有利于荧光淬灭,吸电子取代不利于荧光淬灭,说明荧光是通过PIET过程淬灭的;3.探针对荧光基团和淬灭基团的空间距离具有一定敏感性,增大这两个基团的空间位阻可以显著增强荧光。利用探针的这三点性质,设计合成了Aβ识别探针4P28,对其进行评价发现与Aβ纤维具有高亲和力(Kd=3.5 nM),能有效染色转基因小鼠脑切片中的老年斑。同时,首次发现探针4P28能够在染色后不清洗的条件下,高对比度的观察老年斑,这是目前其他的探针难以实现的。进一步我们设计合成了NIR类探针4P36,对其进行转基因AD小鼠模型体内评价发现,在尾静脉注射给药后5-45 min,其头部荧光标记信号是野生型小鼠的2倍,初步证明探针可用于诊断AD发病,深入的研究还在进行中。
【学位授予单位】：中国科学院上海药物研究所
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R91;R914
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本文编号：2586550