新型微流控混合芯片制备siRNA递送纳米载体的研究

发布时间：2020-03-17 23:59

【摘要】：基于脂质纳米粒的小干扰RNA(siRNA)递送系统对肿瘤等多种疾病有着良好的治疗效果。传统的脂质体制备方法多依赖于宏观尺度的混合,步骤繁琐且重复性差。微流控技术(Microfluidic)可以实现微米尺度下流体的精确操控,从而优化载体制备过程。然而,由于微流控芯片中流体处于层流状态,较低的混和效率制约了其在该领域的进一步发展。本课题中,我们设计了一种通道底部嵌有w状沟槽的微流控芯片。通道内的w状沟槽诱发液流发生混沌现象,极大增加了两相间接触面积,使得高效的混合在数微秒内即可完成。课题随后通过芯片制备了小粒径、单分散的转铁蛋白(transferrin,Tf)修饰脂质纳米粒,并从体外和体内水平对其递送siRNA的能力进行了评价。论文主要研究方法和结果如下:1.芯片设计及纳米粒制备表征本课题在PDMS芯片中加工200×75μm的矩形微通道,并在通道底部刻蚀w状沟槽,沟槽深35μm,宽50μm。由荧光混合效率实验可见微通道内流体的混沌现象被成功诱发。为优化所设计微芯片制备脂质纳米粒的条件,本论文对微通道内总流体流速(total flow rate,TFR),水脂相流速比(flow rate ratio,FRR)和磷脂浓度三因素组合进行了优化。结果表明,微流控芯片在磷脂浓度为5 mg/ml,TFR为735μl/min,FRR为20时制备的转铁蛋白修饰脂质纳米粒(microfluidic prepared transferrin lipid nanoparticles,M-Tf-LNPs)各参数最佳。此时M-Tf-LNPs平均粒径为110 nm,多分散系数(PDI)为0.15,比批量式(Bulk)乙醇注入法所制备的同处方纳米粒(B-Tf-LNPs)粒径小90 nm左右,PDI小0.12。室温存放7天后,M-Tf-LNPs的粒径分布未发生明显变化。2.M-Tf-LNPs的体外抗肿瘤效果评价课题随后对所制备纳米粒的体外安全性、细胞摄取效率和转染效率进行了评价。MTT实验表明,加入M-Tf-LNPs空白载体培养24 h后,Hep G2细胞活力保持在90%以上,说明其良好的体外安全性。流式细胞术的结果表明,M-Tf-LNPs包载的FAM-siRNA可以在4小时内被细胞快速摄取。激光共聚焦显微镜观察可见,经M-Tf-LNPs介导内化的siRNA主要分布于细胞质中。Western blot评价转染48小时后蛋白敲除效率,结果显示经M-Tf-LNPs递送的siRNA可以有效降低Hep G2细胞中的survivin蛋白表达。3.M-Tf-LNPs的体内抗肿瘤效果评价为评价M-Tf-LNPs在体内的siRNA递送效率,本文构建移植瘤小鼠模型并给以尾静脉注射纳米粒,以考察其体内组织分布情况、肿瘤生长抑制效率及体内生物安全性。组织荧光分布实验表明,包载Cy3-siRNA的M-Tf-LNPs在注射2小时后即开始于肿瘤部位蓄积,且在给药24小时后仍有较高的信号强度,这说明其良好的肿瘤靶向性并能有效延长si RNA的体内循环时间。开始给药后,定期记录绘制肿瘤体积变化曲线并在周期结束后称量瘤重。结果显示,M-Tf-LNPs组可以有效抑制肿瘤体积增长,抑制率达到73%。小鼠体重变化的情况显示治疗组体重变化幅度小于15%;病理切片结果表明,相比注射生理盐水的对照组,MTf-LNPs组小鼠给药结束后主要器官没有发生明显的组织病变和异常,这些结果说明M-Tf-LNPs在模型小鼠体内有良好的生物安全性。综上所述,本课题所设计的w沟槽型微流控芯片具有良好的流体混合效率。相比乙醇注入法,基于w型芯片制备脂质纳米粒的工艺简单、快速,重复性好,所制备的纳米粒粒径适宜,分散单一,在体外体内均能高效递送siRNA进入细胞,降低survivin蛋白表达,起到抑制肿瘤体积增长的效果。
【图文】：

w型芯片，在荧光显微镜下观察其混合效率。结果如图2.3所示：图2.3芯片三通道入口处混合效果示意图由图可见，因为在微通道内液体处于层流状态，在三入口汇流处被两侧鞘液挤压的中心液流有着清晰的两相边界。而随着流体进入带有w沟槽的混合通道，呈黄色荧光的中心液流迅速向通道内其余部位分散。这说明混沌现象被成功诱发，，中心液流在层流状态实现与周边液流的快速混合。2.3.3纳米粒制备条件优化为优化纳米粒制备条件，课题通过DesignExpert软件进一步探讨TFR、FRR和磷脂浓度对纳米粒性质的影响。以上述三因素为组合条件，以粒径和PDI为响应值进行了Box-Behnken设计。实验设计方案及动态光散射法所获得的结果列于表2.1。

图以粒径大小为轴响应参数绘制的响应面曲线图。水平坐标和为FRR和磷脂溶液浓度由图2.5可知，在磷脂浓度一定的情况下，TFR与FRR之间具有良好的相关性，可以通过两者的组合有效地控制粒径大小。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943

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本文编号：2587890