HSF1作为HIV潜伏感染激活剂药物靶点确证的研究

发布时间：2020-03-19 03:41

【摘要】：尽管高效抗逆转录病毒联合疗法(Highly Active Anti-retroviral Therapy,HAART)成功应用于艾滋病患者,有效的控制患者体内HIV病毒,延长了患者的生存期,然而患者体内由于HIV病毒潜伏储存库的存在而需要终生服药。当前对于如何清除HIV潜伏病毒库的策略主要是“Shock and Kill”,即激活HIV潜伏感染,再应用HAART药物或者提高机体免疫系统等方法清除活化的潜伏病毒库,最终达到HIV功能性治愈的目的,使患者不需要长期使用药物而维持HIV病毒不反弹。目前针对HIV潜伏库的形成和持续存在机制研究,开发了通过不同通路重新活化HIV潜伏感染细胞的激活剂。尽管少数药物进入临床试验,但也存在着无法减少HIV潜伏库大小、特异性差和毒副作用大等缺陷。因此,新的HIV潜伏激活靶点的研究,进而开发新型潜伏激活剂的策略是未来HIV潜伏激活方面的研究热点。热休克因子(Heatshockfactor,HSF)是热休克反应中的关键因子,广泛存在于真核细胞中的转录因子。在非应激状态下,HSF1主要是以无活性的单体形式存在。当受到刺激时,HSF1形成有活性的三聚体形式进入细胞核,同时发生各种修饰。我们前期研究发现,HSF1可能是潜伏HIV激活过程中重要的转录调控因子,基于此靶点的药物有可能成为新型的HIV潜伏感染激活剂。此前研究使用的药物成药性低且具有一定毒副作用,可能是靶点选择性不高的原因。因此本课题旨在确证HSF1为新型HIV潜伏感染激活剂的药物作用靶点,并为下一步开发出作用于HSF1的安全高效的新型潜伏感染激活剂提供理论基础。本课题首先利用CRISPR/Cas9技术,建立敲除HSF1的HIV潜伏感染细胞模型,应用经典潜伏感染激活剂和已报道的通过活化HSF1蛋白而促进HIV潜伏激活的药物,作用于未敲除细胞和敲除HSF1的细胞,随后通过流式细胞技术、蛋白印迹等方法验证敲除了 HSF1蛋白后,经典潜伏感染激活剂并不会显著下调HIV潜伏感染水平,而通过活化HSF1而激活HIV潜伏感染的药物其HIV潜伏激活能力明显下调。为探究这一现象,我们构建了 HSE驱动的Luciferase-HSE质粒,通过慢病毒感染的方式整合到HEK-293T细胞中,构建了稳定表达Luciferase-HSE的HEK-293TLuciferase细胞。再利用CRISPR/Cas9技术对该细胞的HSFI基因进行敲除,筛选得到了敲除HSF1的HEK-293TLuciferase细胞。利用上述药物处理细胞,比较其Luciferase变化比率,相较于未敲除HSF1细胞,经典HIV潜伏激活剂在敲除HSF1的细胞的Luciferase 比率在同一浓度下有下调,而通过HSF1激活潜伏HIV的潜伏激活剂其Luciferase反而增加。表明HSF1是潜伏激活剂激活潜伏HIV的机制之一,但细胞内仍有其他因子可替代HSFI作用于HSE从而发挥潜伏HIV激活的作用。为了探究HSF1的替代蛋白,我们检测了与其相关的PARP1(poly ADP-ribose polymerase-1)蛋白,检验了 PARP1激活潜伏HIV的能力,通过流式细胞术、RT-qPCR、Western Blotting等方法,确定了 H2O2诱导的DNA损伤可以激活潜伏HIV,而应用PARP1抑制剂后,其激活水平下降,同时H202无法下调敲除HSF1 的 HEK-293T-HSELuciferase细胞的 Luciferase强度。因此,PARP1 可能作为HIV潜伏细胞中HSF1的替代蛋白。综上所述,HSF1可作为新型HIV潜伏感染激活剂研究的药物靶点,为下一步开发以HSF1为靶点的特异性潜伏激活剂提供理论依据,期望发现的化合物能清除HIV潜伏感染库,为最终实现功能性治愈提供新的药物治疗手段。
【图文】：

激活剂,药物

途径重新活化潜伏ＨＩＶ的潜伏感染激活剂。目前主要分为如下几类：逡逑１）免疫调节类：主要有细胞因子组成，包括白介素家族的ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５逡逑以及ＣＤ３、ＣＤ２８抗体等，介导细胞的活化而促进潜伏ＨＩＶ的活化［４１Ｌ逡逑２）转录因子类：①：通过激活剂蛋白激酶Ｃ邋（ＰＫＣ），促进ＰＫＣ磷酸化，逡逑从而促进其下游转录因子ＮＦ－ｋＢ和ＡＰ－］与病毒ＬＴＲ结合，介导病毒转录起始，逡逑代表药物有Ｐｒｏｓｔｒａｔｉｎ、Ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ等［４２，４３１；②：激活ｐ－ＴＥＦｂ转录复合物活性，逡逑促进Ｔａｔ蛋白与其结合共同促进ＨＩＶ转录延伸，，代表药物有ＪＱ１、ＨＭＢＡ等ｆ４４，４５］。逡逑３）表观遗传修饰类：①组蛋白去乙酰化酶抑制剂，可使染色体中的核小体逡逑趋向于不稳定状态，暴露出缠绕在核小体上的病毒ＤＮＡ，促使ＨＩＶ转录的延伸逡逑从而激活ＨＩＶ的转录，代表药物有ＳＡＨＡ邋（伏立诺他）、Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ等［４６４８］；逡逑②ＤＮＡ甲基化酶抑制剂，代表药物有ＤｅＣｉｔａｂｉｎｅ［４１ｌ；③组蛋白甲基转移酶，代逡逑表药物有邋Ｃｈａｅｔｏｃｉｎ［４９］。逡逑各类潜伏激活剂胞内信号转导通路如下图：逡逑ＨＭＴｉｎＮｈｆｔｏｎ逡逑

作用机制,蛋白酶体抑制剂,潜伏感染,压力诱导

硕士学位论文逡逑ＨＳＦ１与潜伏ＨＩＶ激活逡逑我们前期研宄发现，ＨＳＦ１与ＨＩＶ潜伏感染的激活相关。应用应激压力诱导逡逑Ｓａｌｕｂｒｉｎａｌ、蛋白酶体抑制剂Ｃａｒｆｉｚｏｍｉｂ／Ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ诱导潜伏ＨＩＶ激活，研宄逡逑ＨＳＦ１发生磷酸化后进入细胞核，同时募集ｐ３００促进自身乙酰化，进一步逡逑ＨＩＶＬＴＲ结合，诱导Ｈ１ＶＤＮＡ转录起始，同时，ＨＳＦ１还可募集ｐ－ＴＥＦｂ产逡逑转录延仲。进－步研究发现，ＨＳＦ１可促进下游ＨＳＰ９０的表达，从而保护了逡逑ＥＦｂ亚基ＣＤＫ９不发生发生泛素化降解，正反馈调节ＨＳＦ１的作用［５６，５７］。逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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