氯化镉诱导MC3T3-E1 Subclone14细胞凋亡的线粒体途径及EGCG的保护作用研究

发布时间：2020-03-19 17:15

【摘要】：目的:研究线粒体信号通路和JNK通路对氯化镉诱导MC3T3-E1 Subclone14细胞凋亡的影响,以及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对氯化镉诱导细胞凋亡的作用,为防治镉引起的骨代谢疾病提供理论基础。方法:1.CCK-8法检测EGCG与氯化镉对细胞存活率的影响。2.ALP试剂盒检测EGCG与氯化镉对细胞ALP活力的影响。3.光学显微镜观察氯化镉对细胞形态的影响,Annexin V-FITC/PI、Hoechst和TUNEL荧光染色法观察氯化镉对细胞凋亡的影响。4.JC-1法检测EGCG与氯化镉对细胞线粒体膜电位的影响。5.QPCR法检测EGCG与氯化镉对细胞转录因子RUNX2、I型胶原COL-1和凋亡相关基因Caspase 9、Caspase 3、Bcl-2、Bax和Cytoc表达的影响。6.免疫荧光法检测Z-VAD-FMK与氯化镉对细胞cleaved-caspase 3蛋白表达的影响。7.Western-blot法检测Z-VAD-FMK、SP600125、EGCG与氯化镉对细胞成骨相关蛋白RUNX2、COL-1、ALP和凋亡相关蛋白Caspase 9、Caspase 3、Bcl-2、Bax和Cytoc表达以及JNK、p-JNK蛋白表达的影响。结果:1.与对照组比较,5、10、20、30、40、50、100μM氯化镉单独处理细胞60 h后,细胞存活率均显著降低(P0.01);10μM氯化镉能诱导细胞凋亡;5、10、20μM氯化镉能明显降低细胞Caspase 9、Cytoc蛋白的表达和Bcl-2/Bax的比值(P0.05),升高p-JNK/JNK比值(P0.05);5、10、20μM氯化镉显著性降低RUNX2、COL-1基因表达(P0.01);20μM氯化镉能明显抑制ALP活性并降低RUNX2、COL-1蛋白表达(P0.05),而5、10μM氯化镉对其无统计学意义(P0.05)。2.Caspase抑制剂Z-VAD-FMK与20μM氯化镉单独或联合处理细胞60 h后,未处理组细胞呈纤维状,氯化镉处理组细胞皱缩呈圆泡状,Z-VAD-FMK与氯化镉联合处理后细胞皱缩数目减少;与氯化镉单独处理组比较,Z-VAD-FMK与氯化镉联合处理组能显著升高Caspase 9蛋白表达和Bcl-2/Bax的比率,并使cleaved-caspase 3蛋白表达显著性降低(P0.05);与氯化镉单独处理组比较,Z-VAD-FMK与氯化镉联合处理组显著升高RUNX2蛋白的表达(P0.05),而对ALP、COL-1无统计学意义(P0.05)。3.JNK抑制剂SP600125预处理1 h,20μM氯化镉干预细胞60 h后,SP600125能改善镉引起的细胞形态变化,显著降低镉引起的JNK磷酸化水平的升高并显著抑制Bcl-2/Bax比值的降低(P0.01或P0.05),而对镉降低的凋亡相关蛋白Caspase 9、Cytoc以及成骨相关蛋白RUNX2、ALP和COL-1表达无统计学差异(P0.05)。4.EGCG与氯化镉单独或共同处理细胞60 h后,与氯化镉组比较,EGCG与镉联合处理组细胞存活率和线粒体膜电位显著性升高;Caspase 9基因和蛋白表达及Bcl-2/Bax的比率显著性增加,p-JNK/JNK比值明显降低(P0.05);ALP活性明显升高(P0.05)。结论:1.氯化镉能降低MC3T3-E1 Subclone14存活率并诱导细胞凋亡;抑制ALP活性并下调RUNX2、COL-1基因和蛋白的表达;2.氯化镉通过线粒体Caspase依赖型途径和激活JNK通路诱导细胞发生凋亡;3.EGCG能降低镉诱导的细胞损伤率和细胞凋亡率,其保护作用可能是通过上调Caspase 9和Bcl-2/Bax比值并下调p-JNK/JNK比值来实现的。
【图文】：

图 1 线粒体介导的细胞凋亡表没食子儿茶素没食子酸酯 EGCG 的药理作用中国是茶的发源地，饮茶文化在中国已经历经四五千年了。茶具有保健作用，能减病的发病风险，，降低胆固醇，防治老年痴呆，增强免疫力等。茶的有效活性成分有酚、茶色素、茶氨酸、茶多糖等。茶多酚是绿茶中含量最多的可溶性物质。绿茶的与各种疾病，包括癌症、心血管疾病、糖尿病、过敏、哮喘、关节炎、神经系统问肥胖症的发病率较低有关。报道表明，绿茶有许多好处，如调节内分泌系统、免疫、食欲和脑功能，这些与儿茶素的抗氧化和自由基清除活性相关。其他研究证实茶对髋部骨折有保护作用。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)是茶多酚的有效活性物是一种多酚类物质，在绿茶中的含量最高。EGCG 是一种黄烷醇类化合物，对金属

图 2 EGCG 分子结构图EGCG 具有广泛的治疗特性，包括抗动脉粥样硬化、抗心病、抗炎和抗氧化作用。这些治疗作用主要与抑制 LDL 胆 NF-κB(抗心脏肥大)，抑制 MPO 活性(抗心肌梗塞)，降低平(抗糖尿病)，炎症标志物的减少(抗炎)以及 ROS 产生的抑 具有多种药理活性，比如抗氧化、解毒、抗紫外辐射、抗，EGCG 的这些药理作用得到了深入的研究。合重金属作用证明，EGCG 能够抗氧化且具有螯合重金属的作用。EGC功能障碍和脂质过氧化反应[45]；减轻砷诱导的大鼠心脏毒起的大鼠肾损伤[47]；缓解小鼠造血系统的辐射损伤，并且
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R99

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本文编号：2590468