缺氧环境下BaP对CMA的影响与HSP90相互关系的研究

发布时间：2020-03-19 18:03

【摘要】：目的:本研究拟在缺氧环境下,采用不同浓度的BaP处理A549细胞,探讨BaP对分子伴侣介导自噬(CMA)的作用是否与HSP90有关。方法:(1)采用CoCl_2构建细胞缺氧环境,qPCR法检测HIF-1α的mRNA表达,确定缺氧环境是否构建成功;(2)采用qPCR和Western bolt法检测缺氧环境对A549细胞中HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达影响;(3)采用qPCR和Western bolt法检测不同浓度BaP对缺氧环境下A549细胞中HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达影响;(4)采用qPCR和Western bolt法检测BaP对缺氧环境下给予HSP90抑制剂Geldanamycin(GA)和沉默HSP90α的A549细胞中HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达情况;(5)采用碱性彗星实验、免疫荧光检测γ-H2AX焦点实验、qPCR和Western bolt法检测不同浓度BaP对A549细胞中DNA损伤与细胞内HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达的影响,进一步探讨DNA损伤与CMA的关系。结果:(1)与常氧组比较,A549细胞在不同时间缺氧后,HIF-1α的mRNA表达量均有一定程度的增加,以缺氧24h后HIF-1α的mRNA表达量最高,差异具有统计学意义(P0.001);(2)缺氧环境下,HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达量与常氧组相比均明显增加,差异具有统计学意义(P0.05);(3)缺氧环境下,1μM BaP作用于A549细胞24h时,HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达量均显著降低,与空白组比较差异具有统计学意义(P0.05);(4)缺氧环境下,给予GA和沉默HSP90α的A549细胞可以增强BaP对HIF-1α、HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达量的抑制作用,与BaP组相比差异具有统计学意义(P0.05);(5)常氧环境下,不同浓度BaP作用于A549细胞24h时,细胞内DNA单、双链断裂的损伤程度及HSP90、HSC70和LAMP-2A的mRNA和蛋白表达量均随着BaP浓度的增加而增加,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:1.缺氧可以促进A549细胞的CMA;2.在缺氧环境下,BaP对CMA有抑制作用;3.在缺氧环境下,HSP90抑制剂和沉默HSP90α的A549细胞可以增强BaP对CMA的抑制作用;4.在常氧环境下,BaP可以导致DNA损伤和CMA相关。
【图文】：

国碧云天）操作：标准品依照表5配制，样品孔加5μL蛋白和15μLPBS。最后在每孔加入200μLBCA工作液（A:B=50:1），室温放置2h。酶标仪测量吸光度并制作标准曲线和蛋白定量，见图1。取定量蛋白80μL和20μL蛋白上样缓冲液混匀，100℃变性10min，-20℃保存。表5 BCA蛋白定量标准品配制终浓度（mg/mL） 0 0.025 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.50.5mg/mL BSA（μL） 0 1 2 4 8 12 16 20PBS（μL） 20 19 18 16 12 8 4 02）SDS-PAGE凝胶电泳配制 10%分离胶（30%Acr/Bic：1.0moL/L Tris·HCL pH8.8：ddH2O：10% SDS：10%APS：TEMED = 6.7mL：7.6mL：5.3mL：200μL：200μL：8μL）和 5%浓缩胶（30%Acr/Bic：1moL/LTris·HCL pH6.8：ddH2O：10% SDS：10% APS：TEMED= 1mL：0.75mL：4.1mL：60μL：60μL：6μL），快速混匀并灌胶插入梳子，待凝固。倒入 1×电泳缓冲液至刻度线上开始上样，，每孔 16μL，避免交叉污染。电压 80V，30min；120V，约 2h

VDF膜、凝胶、滤纸，排尽气泡，合上阴极电板。插上电源，设置电流200mA，120min[26]。配制5%脱脂奶粉（脱脂奶粉：TB于室温封闭1.5h，TBST清洗3次，每次10min，切膜并将条带分α、HSP90、HSC70、LAMP-2A孵育盒中，4℃孵育过夜，TBSTin；再放于二抗中，室温避光孵育1h，TBST清洗3次，每次10析条带灰度值。环境下，不同浓度 BaP 对 A549 细胞 HIF-1α、HSP90、A 表达的影响P 浓度的选择实验室前期工作基础摸索 BaP 浓度在 0-10μM 范围内，作用 A549 细胞的增殖影响不显著。因而本实验选定 BaP 浓度为 0作用 24h 进行后续实验，见图 2。
【学位授予单位】：内蒙古医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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本文编号：2590516