基于硫酸软骨素的环境敏感型自组装纳米粒递药系统的研究

发布时间：2020-03-19 18:11

【摘要】：化学疗法是治疗癌症尤其是黑色素瘤的主要手段,但是全身治疗的方式增加了药物的毒副作用,也增加了多药耐药的风险。聚合物纳米粒因其特殊的纳米结构,在药物递送方面有着良好的应用前景。其中,以多糖为骨架以疏水性小分子修饰的两亲性聚合物具有低毒、生物相容性和生物可降解性等优点,其自组装纳米粒具有制备方法简单、避免引入有机溶剂的优点,作为药物递送载体用于肿瘤治疗的应用受到广泛关注。如何设计多功能的纳米结构提高纳米粒的稳定性、实现药物的肿瘤微环境刺激的可控释放、以及实现多治疗手段合为一体,是目前聚合物纳米粒面临的重要挑战。本文以多糖硫酸软骨素作为亲水性骨架并以疏水性小分子修饰,构建了多种不同的两亲性聚合物并以此制备了稳定性良好、药物释放可控的自组装载药体系。详细考察了该聚合物结构和纳米粒结构之间的关系,以及取代度对纳米粒性质的影响,为纳米粒作为载药体系的应用提供了理论基础。设计了集多种环境响应为一体、多重治疗手段为一体的“All in one”的纳米载体,以期纳米粒在肿瘤部位实现响应性结构解离,促进药物释放,发挥抗肿瘤效果。在体内外深入考察了药物释放机制、组织分布和抗肿瘤应用效果。将理论与技术结合,为纳米载体的应用提供了设计思路。为深入研究聚合物结构与纳米粒的关系,首先设计了以已二酸二酰肼(ADH)修饰的硫酸软骨素(CS)作为氨基修饰的骨架,构建硫酸软骨素-脱氧胆酸(CS-ADH-DOCA,CSAD)梳状聚合物,并制备自组装纳米粒用于化疗药物多西紫杉醇(DTX)的递送。通过调节聚合物中不同疏水性小分子的修饰比例,合成并制备不同取代度(DS,聚合物中100个糖环单元上的DOCA的数量)的CSAD纳米粒。研究了取代度对于自组装纳米粒作为药物递送载体的自组装能力、药物释放行为、肿瘤细胞摄取及对细胞杀伤能力的影响。在深入了解基于多糖的自组装纳米粒特性的基础上,设计环境响应型多功能纳米粒作为药物递送载体并对其抗肿瘤作用进行研究。在合成CSAD聚合物基础上,以含二硫键的胱胺(CYS)作为连接臂将DOCA修饰于CS上,合成了 CS-CYS-DOCA聚合物(CSCD),并以此构建了还原/酶敏感的智能纳米给药系统用于DTX的递送。期望该纳米系统可以在肿瘤微环境高还原电势下发生结构中二硫键的断裂,CS骨架可以在酶的作用下实现特异性降解,从而可以实现DTX在肿瘤细胞内快速释放,发挥抗肿瘤的效果。基于此假设对纳米粒的敏感性裂解和药物的敏感性释放进行了研究,对细胞摄取、药物分布和抗肿瘤及其转移的能力进行了评价。在此基础上,为提高纳米粒的稳定性且同时促进药物在肿瘤部位的快速释放,提高抗肿瘤效果,将化学交联与环境响应相结合;将声动力疗法(SDT)和化学疗法联合,期望建立更加有效的药物递送系统。使用上述合成的ADH修饰的CS作为氨基修饰的亲水性骨架,选择功能性疏水性小分子二氢卟吩e6(Ce6)作为疏水段(超声敏感剂),通过ADH连接到CS骨架,并引入含二硫键的硫辛酸(LA)作为交联剂,依次通过ADH连接到CS骨架,合成CS-Ce6-LA聚合物。以此结构自组装形成可逆交联、还原/酶敏感、并结合化学疗法和声动力疗法为一体的智能纳米给药系统。期望该交联纳米系统在药物递送中面对高倍稀释具有较高的稳定性,在肿瘤微环境发生响应性的去交联和骨架降解,促进药物释放,发挥化疗的作用。同时Ce6在外加超声的作用下,发挥声动力疗法,诱导肿瘤凋亡。对该交联纳米粒的稳定性、药物的包载和响应型释放能力、细胞摄取进行考察。同时在细胞水平对声动力疗法的机制进行深入考察,在体内对化疗-声动力联合疗法对肿瘤及肿瘤转移的治疗效果进行了评价。本论文主要研究内容和结果主要概括如下:(1)构建两亲性CSAD聚合物纳米粒,考察取代度对纳米粒的影响通过两步酰胺反应,将疏水性小分子DOCA通过连接臂ADH修饰到硫酸软骨素CS亲水骨架上,构建两亲性聚合物CSAD。通过控制DOCA与CS的投料比,获得三种不同取代度的CSAD聚合物,紫外分光光度法定量 DOCA的取代度范围为2.5%-7.0%。CSAD聚合物的CAC值在0.027-0.050 mg/ml范围内。通过探头超声方法成功制备了 CSAD聚合物自组装纳米粒,形成的纳米粒形态呈球状,水化粒径分布均一且在160-190nm以内,Zeta电位在-18 mV到-27 mV之间。纳米粒的溶血率均低于5%,表现出良好的生物相容性。采用超声-透析方法制备载药自组装纳米粒DTX-CSAD,当药物-聚合物质量比为3:10时,载药量达到11.8%,粒径分布在180 nm左右,纳米粒呈现球体、形态圆整、分布均一。载药纳米粒的体外释放呈现突释-缓慢释放两个阶段,对于纳米粒来说,较高取代度的载药纳米粒具有较为延缓的释放速率,120 h时DTX的释放百分比随着取代度的增加从75%增加到86%。细胞摄取结果证明了 CSAD纳米粒可通过CD44受体分子介导的细胞内吞实现细胞摄取,且具有一定的时间和浓度依赖性。细胞毒性结果表明,DTX-CSAD纳米粒具有良好的细胞杀伤效果且细胞存活率随着取代度的的增加而降低。综上所示,CSAD纳米粒中疏水端DOCA取代度对纳米粒的自组装行为和药物递释有着一定的影响,取代度增加,粒径降低,CAC值降低,药物释放速度减慢。这主要是因为在两亲性骨架上,疏水基团增加可以提高骨架疏水端分子间作用力,从而赋予纳米粒更易于自组装的能力,因此更易形成紧实的疏水内核。包载疏水性药物DTX后,DTX与DOCA之间疏水作用增强,从而聚合物纳米粒中的药物更加难以释放。此外,取代度越高,CSAD纳米粒的细胞摄取量相应增加,DTX-CSAD纳米粒的细胞毒性越强。通过对取代度的深入研究,可调节取代度实现不同的药物释放速率、以达到不同的治疗效果。(2)还原/酶响应型CSCD纳米粒的设计及抗肿瘤作用的研究将DOCA通过含有二硫键的CYS连接到CS上,构建两亲性聚合物CSCD。CSCD聚合物可以在水溶液中自组装形成纳米粒,获得还原/酶敏感的智能CSCD纳米粒用于DTX的递送。其CAC值较低(0.022-0.048 mg/ml),形成纳米粒呈球状,水化粒径分布均一且在130-170 nm以内,Zeta电位在-18 mV到-22 mV之间;纳米粒的溶血率均低于5%。通过优化的超声-透析方法制备了 DTX-CSCD载药纳米粒,当药物-聚合物质量比为3:10时,载药量达到15.6%,粒径分布在175 nm左右,纳米粒形态圆整。CSCD纳米粒具有良好的环境响应性,在体外通过模拟肿瘤细胞环境中(GSH或/和Hyal-1酶的孵育下),CSCD粒径分布从100-200 nm之间的单峰分布变成双峰,这是因为CSCD纳米粒中亲水骨架CS在酶的作用下发生降解或氧化或CSCD纳米粒中二硫键在GSH的作用下断裂导致纳米粒亲水疏水作用失衡,从而发生结构解离和粒径改变。考察DTX-CSCD载药纳米粒的药物释放,在GSH或Hyal-1酶作用下,药物释放速率均有一定的提升,在GSH/Hyal-1酶的协同作用,释放速率进一步增大。以上结果均证明了制备的纳米载药体系具有良好的还原/酶响应性。细胞水平上,CSCD可以被细胞有效摄取,且摄取机制主要依赖于CD44分子受体介导的细胞内吞,这一主动摄取的过程需要能量的支持;也有部分纳米粒可通过网格蛋白和渗透压介导完成细胞摄取。DTX-CSCD具有良好的细胞毒性,在纳米粒中DTX浓度为50μg/ml孵育72h,细胞存活率低于20%。分别在Wistar大鼠和C57小鼠中进行了DTX-CSCD的药动学和组织分布实验,同时以无还原响应性的DTX-CSAD纳米粒作为对照。大鼠药动学结果表明,DTX-CSCD和DTX-CSAD显著延长了DTX在血液中的滞留时间,减慢药物被清除的速率,半衰期分别为Taxotere(?)的4.3倍和3.5倍。小鼠组织分布特征结果得出以下结论:DTX-CSCD和DTX-CSAD显著提高了药物在肿瘤部位的聚集,2 h时DTX-CSCD和DTX-CSAD在肿瘤部位的药物浓度分别为Taxotere(?)的6.1倍和3.2倍。载药纳米粒还降低了药物在心脏中的分布,降低了药物在体内的非特异性毒性。此外,相对于Taxotere(?),DTX-CSCD和DTX-CSAD在肺中分布较多,这有利于纳米粒发挥抗肺中肿瘤转移的功能。体内药效学结果表明,载药纳米粒具有良好的抗肿瘤和抑制肿瘤转移的效果。可以显著的抑制荷瘤小鼠的瘤体积,1 8天时DTX-CSCD和DTX-CSAD纳米粒和Taxotere(?)组的肿瘤体积分别为生理盐水对照组的12.6%、25.6%和38.4%。肿瘤组织HE染色和TUNEL分析进一步证明了载药纳米粒通过促进细胞凋亡和死亡来达到抑制肿瘤生长的效果。载药纳米粒可以显著降低肺部肿瘤转移结节的数量,减轻肺部病理状态。同时,肿瘤组织的免疫组化分析结果表明,DTX-CSCD和DTX-CSAD纳米粒能显著降低肿瘤转移相关蛋白环氧化酶-2(COX-2)的表达水平。相对于DTX-CSAD纳米粒组,DTX-CSCD纳米粒组具有较小的肿瘤体积和诱导更高的细胞凋亡百分比,体现了还原/酶敏感的CSCD纳米粒作为多重环境响应的药物递送载体在促进药物释放,提高抗肿瘤及抗肿瘤转移效果的优越性。(3)还原/酶响应型可逆交联X-NPs纳米粒的设计及其化疗-声动力联合疗法抗肿瘤作用的研究基于CSCD的设计,为进一步提高聚合物纳米粒的稳定性,同时结合多种抗肿瘤手段,采用超声敏感剂Ce6疏水小分子作为疏水改性剂,从而引入声动力疗法(SDT);采取交联手段与还原响应相结合,引入可逆交联策略,以期实现更加优越的抗肿瘤效果。依次将Ce6和交联剂LA分别通过ADH连接到CS上,获得两亲性聚合物CS-Ce6-LA。聚合物自组装获得非交联纳米粒(NX-NPs),通过分子间二硫键交联得到可逆交联纳米粒(X-NPs),作为DTX的载体。X-NPs具有还原/酶敏感特性,可实现化疗-声动力治疗的联合治疗手段。形成的纳米粒呈球状,粒径分布均一。其中,NX-NPs粒径在133-233 nm以内,Zeta电位在-12 mV到-22 mV之间。经过交联,X-NPs粒径比NX-NPs的粒径低,分布范围为118-197 nm,Zeta电位在-16 mV到-23 mV之间。X-NPs的溶血率均低于5%。利用超声-透析方法制备了载药纳米粒DTX/X-NPs,当药物-聚合物质量比为3:10时,载药量达到16.6%,粒径分布在160.9 nm左右。X-NPs具有良好的稳定性,在高离子强度溶剂、有机溶剂以及高倍稀释的刺激下,X-NPs保持了胶体稳定性,粒径只有稍许增加。而NX-NPs在同样条件下,难以保持原有的纳米粒特性,部分降解为单聚体。X-NPs在GSH/Hyal-1酶作用下发生明显的还原/酶敏感性裂解。交联纳米粒显著降低了药物的释放速率,72 h时,约62.3%DTX从非交联纳米粒DTX/NX-NPs中释放,而DTX/X-NPs的释放量不足DTX/NX-NPs的一半。但DTX/X-NPs在GSH和GSH/Hyal-1酶的作用下,释放百分比分别增加到72.3%和97.8%。对比之下,DTX/NX-NPs的药物释放不受GSH的影响。以上结果说明了 X-NPs可以显著提高纳米粒的稳定性和减缓药物释放,而在模拟肿瘤细胞环境中去交联从而加速药物的释放;体现了交联与响应刺激相结合的优越性,这一特性也完美的解决了化学交联方式药物在靶部位难以释放的缺点。细胞对X-NPs具有理想的摄取量。DTX/X-NPs+SDT的化疗-声动力协同治疗具有显著的肿瘤杀伤能力,DTX/X-NPs+SDT联合疗法的细胞毒性显著高于单纯DTX/X-NPs化疗方式的结果,且细胞毒性随着超声时间从1 min到3 min显著增加,超声5 min中未见更优越的效果。X-NPs+SDT诱导细胞凋亡率约为Ce6+SDT结果的2倍,这可能与X-NPs具有较高的细胞摄取量有关。进一步对SDT促进凋亡机制进行研究,发现SDT可诱导活性氧(ROS)产生,jc-1探针检测线粒体膜电位MMP发现SDT促进MMP的降低;通过PCR检测发现SDT促进线粒体内的凋亡相关mRNA表达的变化,通过Western Blot检测部分细胞凋亡相关蛋白表达上升。因此SDT诱导细胞凋亡的方式可概括如下:X-NPs被细胞摄取入胞后,纳米粒骨架中Ce6在超声的刺激下促进胞内ROS大量产生,ROS具有一定的细胞毒性,激活线粒体-半胱天冬酶(Caspase)凋亡通路,促进细胞凋亡。即线粒体受损失,MMP下降,线粒体Bax表达上升,Bal-1表达下降,即引起下游Cytochrome C表达上升,激活Caspase家族,引起Caspase-9的降解,进而激活下游信号,引起下游Caspase-3的降解。Caspase-3的降解引起PARP的降解,PARP可能参与细胞凋亡的后期过程。DTX/X-NPs的药代动力学结果表明,DTX/X-NPs通过改变DTX在血液中的存在形式,显著地提高血药浓度,延长DTX在血液中的滞留时间。小鼠注射游离Ce6或X-NPs后,在不同时间点取出各组织,用小动物活体成像仪进行体外显影,记录Ce6的荧光强度。结果发现:相比于Ce6溶液,基于CS-Ce6-LA聚合物制备的X-NPs可提高Ce6在肿瘤的荧光强度,并延长在肿瘤部位的滞留时间。X-NPs在肺中分布较多,这有利于纳米粒发挥抗肺中肿瘤转移的功能。体内药效学结果表明,化疗-声动力疗法联合治疗比单一疗法具有更显著的抗肿瘤作用,实验 18 天后,DTX/X-NPs+SDT、X-NPs+SDT、DTX/X-NPs 和 Taxotere(?)分别为生理盐水对照组瘤体积的0.6%、10.0%、14.9%和61.8%。肺部肿瘤转移结节数量结果、Western Blot和免疫组化考察肿瘤组织的转移相关蛋白的表达结果表明,化疗、SDT以及联合治疗可显著降低肺中转移结节的数量,降低肿瘤转移相关蛋白COX-2和uPA的表达水平,其中联合疗法结果最优。这体现了还原/酶敏感的DTX/X-NPs作为药物递送载体在肿瘤细胞中实现化疗药物快速释放和在超声作用下诱导细胞凋亡的联合治疗的优越性。值得关注的是,DTX/X-NPs+SDT、X-NPs+SDT两组促进了肿瘤微环境CD8+细胞毒性T细胞(CTLs)的浸润,两组的CTLs百分比分别为1.6%和1.4%。对于无SDT参与的生理盐水组,Taxotere(?)组和DTX/X-NPs组,CTLs的百分比均小于0.3%。SDT同时也促进细胞因子γ-干扰素(INF-γ)的浸润,引起机体自身的抗肿瘤免疫反应。这一结果增加了 SDT用于抗肿瘤治疗的潜力,为肿瘤免疫治疗的应用提供了实验基础。
【图文】：

以一定量的ＥＤＣ／ＮＨＳ进行ＤＯＣＡ羧基端的活化和ＤＯＣＡ－ＮＨＳ的合成，并加入一逡逑定量的ＴＥＭＥＤ终止活化反应。通过ＣＳ－ＡＤＨ与ＤＯＣＡ－ＮＨＳ的酰胺反应，获得两亲性聚逡逑合物。合成路线如图１－１所示。逡逑（Ｒ－ＳＯ３－邋ｏｒ邋Ｈ）逦0＾Ｈ３逦ｎ逡逑ＣＳ逦ＡＤＨ逡逑ｎｈ２逡逑ＮＨ逡逑０邋人逦ＮＨｂ，逡逑Ｘ逡逑ｘ邋Ｖ。邋＋逡逑0、ｎｈ逦口逦Ｎｒ逡逑、舟。今么於。、逦枿逡逑（Ｒ＝Ｓ０３－0ｒＨ）逦0＾ＣＨａ逦０Ｒ逦》ＣＨ逦Ｊｎ逡逑°邋３逦ＥＤＣ邋ＮＩＩＳ邋ＴＥＭＥＤ逡逑＾邋）逡逑0Ｓ５＾逦ＮＨ逦ｃｈ３邋0逦ｊ逡逑＼逦＼邋Ｊ逡逑ＮＨ逦ＯＲ邋0Ｒ逡逑Ｌ（Ｒ＾ｏｔｈ，邋°＞Ｃ＾邋0Ｈ邋－邋＞Ｈｃｈ３逡逑ＣＳＡＤ逡逑图１－１邋ＣＳＡＤ的合成路线图逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ＣＳＡＤ逡逑硫酸软骨素－己二酸二酰肼（ＣＳ－ＡＤＨ）的合成［７３］邋？？精确称取０．２邋ｇＣＳ邋（０．５邋ｍｍｏｌ），逡逑溶于适量蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，向其中依次加入０．８邋ｇ邋ＥＤＣ邋（４．０邋ｍｍｏｌ），０．１１７邋ｇ逡逑（１．０邋ｍｍｏｌ）邋ＮＨＳ，以盐酸调节酸碱度至ｐＨ值６－７，搅拌１５ｍｉｎ左右，活化ＣＳ中的羧逡逑３５逡逑

ＮＨＳ的催化下生成活性酯，然后其活化的羧基端与ＣＳ－ＡＤＨ的另一端氨基端进行酰胺反逡逑应。为了防止ＣＳ分子间由ＡＤＨ交联，合成过程中加入过量的ＡＤＨ。在ＣＳ的１Ｈ邋ＮＭＲ逡逑中，化学位移在２．０１邋ｐｐｍ为ＣＳ结构中乙酰甲基氢质子的特征吸收峰（图１－２中ａ所逡逑示），化学位移在３．２３－４．６５邋ｐｐｍ为糖环骨架氧质子的吸收峰。在ＣＳ－ＡＤＨ图谱中，，ＡＤＨ逡逑中亚甲基中氢的特征吸收峰出现在化学位移１．６５－１．８２邋！）ｐｍ和２．２0－２．４５邋ｒｏｍ处（图１－２中逡逑ｂ－ｅ所示），这主要由ＡＤＨ上不同亚甲基的化学环境不同所致。根据该吸收峰的峰面积逡逑与糖环结构中乙酰甲基氢质子的特征吸收峰的峰面积之比可以求得在ＣＳ－ＡＤＨ中ＡＤＨ的逡逑摩尔取代度（每一百个糖环单元上偶联的ＡＤＨ的个数）。在ＣＳＡＤ图谱结果中，化学位逡逑移０．７７邋ｐｐｍ附近出现的吸收峰归属于ＤＯＣＡ残基中１８、１９及２１位上的角甲基的特征氢逡逑质子峰（图１－２中ｆ－ｈ所示），根据该信号峰的峰面积与糖环结构中乙酰甲基氢质子的吸逡逑３７逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943


本文编号：2590524