SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体的研究

发布时间：2020-03-20 05:23

【摘要】：目的:1.制备SPIO(超顺磁氧化铁纳米粒)示踪的MISO(米索硝唑)pH敏感脂质体,并优化处方及制备工艺;2.建立测定SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体中MISO的含量及体外释放度的方法;3.建立测定SPIO示踪的MISO p H敏感脂质体SPIO的含量及体外释放度的方法。4.构建人肺腺癌A549细胞系乏氧模型,模拟实体肿瘤乏氧微环境;5.考察SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体体外pH敏感特异性。方法:1、采用逆相蒸发法+冻融法制备SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体,以包封率及体外释放度为考察指标,采用正交设计,并筛选最优处方。2、采用金属粒子沉淀法+紫外光谱法,测定MISO pH敏感脂质体药物含量及体外释放度;3.采用邻菲罗啉分光光度法测定SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体溶液中的SPIO的含量及体外释放度;4.采用二氯化钴(Cobaltous Chloride,Co Cl_2)化学诱导法构建乏氧模型,体外培养的A549细胞分别加入不同浓度CoCl_2培养液作用不同的时间(24h,48h,72h),采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测乏氧对A549细胞增殖的影响并筛选出合适的浓度和作用时间;5、以人肺腺癌细胞A549为细胞模型,分乏氧实验组和常氧对照组,乏氧实验组加入适当浓度CoCl_2培养基作用适当时间,常氧对照组加入无血清培养基作用相同时间,然后给予空白脂质体和载药脂质体,分别孵育2h,4h,8h,16h,24h后对细胞进行预处理。用紫外光谱法测定胞外MISO药物浓度;用原子吸收光谱法测定胞外SPIO浓度,并与对照组比较。结果:1.HPLC(高效液相色谱法)证实ZnCl_2可完全沉淀磷脂酰乙醇胺,标准曲线为:A=0.0328C-0.008,r=0.9996(n=6),线性范围为:0.96~30.72μg·mL~(-1),回收率在98%~102%之间,RSD2%(n=3)。供试品含量平均质量分数100.11%,释放度试验中SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体在pH5.5,pH6.5,pH7.4的缓冲液中,24h累计释放度分别为63.4%、39.6%、30.6%;2.采用邻菲罗啉分光光度法检测SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体的铁含量及释放度,求得到标准曲线为:A=0.1031C+0.0032,r=0.9995(n=6),线性范围为:0.20~8.00μg·mL~(-1),回收率在98%~102%之间,RSD2%(n=3);3.通过正交试验优化并综合分析,兼顾MISO及SPIO包封率与累计释放度,最终确定制备SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体的最佳处方为:PE(磷脂酰乙醇胺):CHO(胆固醇):LA(亚油酸):CMC(羧甲基壳聚糖)(W/W)3:1:1:0.05,有机相:水相(V/V)4:1,药脂比1:20,PBS量8ml;冷冻:融化温度-80:50,SPIO量20%,冻融次数3次,冷冻:融化时间50:30。通过上述方法学测定,其中MISO的包封率为30.2%,SPIO包封率为23.7%。在不同p H条件下的释放度测试,结果显示SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体,在pH5.5、p H6.5、pH7.4的缓冲液中MISO 24h的累计释放度分别为81.1%、60.6%、32.5%。SPIO 24h的累计释放度分别为90.4%、64.5%、36.6%。用粒度/Zeta电位测定仪测得SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体粒径呈现正态分布趋势,平均粒径为950nm左右,点位图提示其带负电荷,为-58.9mV。扫描电镜显示,SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体呈圆形或类圆形,形体较均匀;透射电镜显示制备的SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体呈类圆形黑色点。磁化曲线显示SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体具有超顺磁性。4.当CoCl_2浓度200μmol/L作用24 h时,细胞增值抑制率未出现明显变化,随着CoCl_2浓度的增加(≥200μmol/L)或者时间的延长,细胞增殖抑制明显,其抑制作用与Co Cl_2呈剂量-时间依赖关系。5.加入不同浓度的SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体后,常氧对照组与乏氧实验组在同一浓度的不同时间条件下,常氧对照组上清液中MISO浓度较乏氧实验组低,通过统计学方差分析,其比较有显著性差异(P0.0001);常氧对照组与乏氧实验组在不同浓度条件下,其上清液中MISO浓度的比较也有显著性差异(P0.0001)。结论:1、采用逆相蒸发法+冻融法制备高包封率和高载药量SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体,制得的脂质体性质稳定,载药量高。2、紫外光谱结合金属粒子沉淀法测定方法结果准确可靠、重现性好,与HPLC法比较,具有简便、快速的优点,可作为MISO pH敏感脂质体的质量控制方法。3、邻菲罗啉分光光度法测定SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体内的SPIO含量以及释放度,选择性好,显色灵敏,结果满意。4、Co Cl_2化学诱导法建立肿瘤细胞乏氧模型,模拟实体肿瘤乏氧微环境,方法简单,重复性好。5、SPIO示踪的MISO pH敏感脂质体具有高度pH敏感性。
【图文】：

其放疗高效增敏优势，解决放疗增敏剂高效高毒、无毒低效的问题，为其再次进入临床打下基础，向临床提供一种高效无毒的放疗增敏剂。图1. 米索硝唑结构式Figure1. Misozonazole chemical structure

西 南 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文结 果考察的确定2 可知，MISO 在 322nm 处有最大吸收，由图 3 可知，辅 322nm 处仍有较大吸收，对药物测定干扰最大，，胆固 E、羧甲基壳聚糖，在 322nm 处无吸收，对药物测定过单纯破乳、离心处理后进行药物测定时，无法消除磷测定的影响。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943

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本文编号：2591320