Arenobufagin抑制前列腺癌细胞转移的作用及分子机制研究

发布时间：2020-03-20 02:19

【摘要】：研究背景和目的:上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)在前列腺癌转移中扮演着重要角色,因此,开发EMT抑制剂可能是治疗转移性前列腺癌的可行策略。Arenobufagin是本课题组从蟾酥中分离得到的抗肿瘤药物先导物,能抑制多种实体肿瘤的增殖。本课题的目的是评价arenobufagin能否抑制前列腺癌PC3细胞的EMT和转移,并揭示其作用机制。研究方法:(1)MTT法检测arenobufagin对PC3细胞的非毒剂量;(2)罗丹明-鬼笔环肽染色实验观察细胞骨架的变化;(3)蛋白免疫印迹法检测PC3细胞EMT标志物的表达水平;(4)Wound healing实验和Transwell实验评价arenobufagin对PC3细胞迁移、侵袭能力的影响;(5)免疫荧光实验观察arenobufagin对β-catenin核转位的影响;(6)qPCR检测β-catenin/TCF/LEF-1复合物相关靶基因的mRNA水平;(7)双荧光素酶报告基因实验检测β-catenin/TCF/LEF-1复合物的转录活性;(8)在PC3细胞上瞬时转染β-catenin过表达质粒和β-catenin siRNA,考察β-catenin在arenobufagin介导的EMT抑制作用中扮演的角色;(9)构建裸鼠皮下异移植瘤模型和肺转移瘤模型,体内评价arenobufagin抑制PC3细胞EMT和转移的活性;免疫组化法检测异移植瘤EMT相关蛋白的表达水平;HE染色观察肺组织转移灶的形成以及各脏器组织的病理情况。研究结果:MTT实验测得arenobufagin对PC3细胞的非毒剂量为8 nM,即细胞增殖抑制率为10%对应的药物浓度;罗丹明-鬼笔环肽染色实验结果显示,arenobufagin处理前后,PC3细胞的形态由间质表型(纺锤体型)转换成上皮表型(圆形);蛋白免疫印迹结果显示,arenobufagin下调间质表型标志物(ZEB1、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug和Twist1),上调上皮表型标志物(E-cadherin、ZO-1和Claudin-1)的表达;Wound healing实验和Transwell实验结果显示,arenobufagin抑制PC3细胞的迁移和侵袭能力;以上结果表明arenobufagin抑制PC3细胞的EMT。另外,arenobufagin下调了PC3细胞β-catenin的mRNA和蛋白水平;免疫荧光实验结果显示,arenobufagin抑制β-catenin的核转位;双荧光素酶报告基因实验结果显示,arenobufagin抑制β-catenin/TCF/LEF-1复合物的转录活性;qPCR结果显示,arenobufagin下调β-catenin/TCF/LEF-1复合物调控的与肿瘤侵袭转移相关的靶基因mRNA水平。β-catenin的过表达和敲低分别拮抗和协同arenobufagin抑制PC3细胞EMT的活性,说明β-catenin参与了arenobufagin抑制PC3细胞EMT的作用。体内活性评价数据显示,arenobufagin抑制PC3细胞裸鼠移植瘤的EMT间质标志物,上调上皮标志物的表达,减少肺转移灶的形成,同时arenobufagin对裸鼠各脏器组织无明显损害作用。研究结论:本研究首次揭示arenobufagin通过下调β-catenin抑制PC3细胞EMT,从而抑制前列腺癌细胞的转移,为arenobufagin发展成为治疗转移性前列腺癌的候选药物提供理论依据。
【图文】：

图 1-1 EMT 发生过程（J Clin Invest. 2009; 119(6): 1420 1428.）1.2.1 与 EMT 相关的信号通路细胞中的EMT过程是由生长因子（EGF，PDGF，HGF）或其它信号蛋白如TGF-β/Smad，音猬因子（Sonic hedgehog，Shh），Wnt /β-catenin 和 ECM 组分等驱动[19]，其中 TGF-β/Smad和 Wnt /β-catenin 是调控 EMT 的两条主要通路。TGF-β 除了通过 SMAD 蛋白促进 EMT，也可以激活 PI3K-AKT，，ERK MAPK，p38 MAPK 和 JNK 通路。TβRI 磷酸化衔接蛋白SRC 同源 2 结构域包含的转化 A（SRC homology 2 domain-containing-transforming A，SHCA），SHCA接着激活生长因子受体结合蛋白2（Growth factor receptor-bound protein 2，GRB2）和交换因子（Son of sevenless，SOS），从而激活 RAS-RAF-MEK-ERK MAPK 通路，促使 EMT 发生。肿瘤坏死因子受体相关因子 6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）与TGF-β受体复合物相互作用后，激活TGF-β激活激酶（TGF-β-activated kinase 1，TAK1），p38 MAPK 和 JNK。一些生长因子，包括表皮生长因子（Epidermal growth factor，EGF），

图 1-2 与 EMT 相关的信号通路（Nat Rev Mol Cell Biol. 2014; 15(3): 178-96.）1.2.1.1 TGF-β/Smad 通路TGFβ 是 EMT 最主要的诱导因子，对非肿瘤性上皮细胞来说是生长抑制剂，而在晚期癌症中是肿瘤启动子[16]。TGFβ 通常通过 TβRII（II 型；也称为 TGFR2）和 TβRI（I 型；也称为TGFR1）受体的复合物启动信号通路，受体激活的SMAD2和/或SMAD3与SMAD4结合形成三聚体 SMAD 复合物，随后，SMAD 复合物发生核转位，与调控基因序列上的DNA 结合转录因子结合，并通过与转录共激活因子或转录共抑制因子相互作用来激活或抑制转录[21, 22]。TGFβ 通路激活后，SMAD 复合物不仅能够激活 EMT 转录因子的表达，也能够提高它们的活性。TGFβ 通过 SMAD3 依赖性转录诱导 Snail1 表达[23]，而 SMAD3 诱导的心肌素相关转录因子（Myocardin-related transcription factor，MRTF）表达可间接诱导 Snail2表达[24]，SMAD3-SMAD4 也与 Snail1 协同应答 TGFβ，从而抑制编码 E-cadherin 和 occludin[25][26]
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

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本文编号：2591092