酶敏性阿霉素前药胶束包载硝呋齐特抗小鼠乳腺癌肺转移的研究

发布时间：2020-03-21 04:44

【摘要】：癌症已成为危害人类健康的重大疾病之一,其中乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤,且90%以上患者死于肿瘤的转移。转移的部位主要是肺、肝和脑等器官,其中肺部的转移率高达60%以上。乳腺癌及其转移目前常用的治疗手段是手术和放化疗。但是手术切除创伤大,易复发;化疗是一种全身治疗,毒副作用大,且预后较差,常不能有效抑制肿瘤的转移。阿霉素(Doxorubicin,DOX)是一种抗癌活性高、抗癌作用广泛的两亲性蒽环类抗生素,是目前使用最多的化疗药物之一。其作用机制是通过插入DNA链中从而阻断DNA合成。但DOX半衰期短,在使用中可能引起严重的心脏毒性,以及抑制骨髓造血功能等严重毒副反应,故影响其在临床上的应用。硝呋齐特(Nifuroxazide,NFX)是硝基呋喃类药物,属于广谱抗菌药物,近年来的研究表明,该药是信号传导与转录激活因子(Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT-3)抑制剂,可以通过抑制STAT-3通路下调基质金属酶(MMPs)的表达,从而达到明显抑制肿瘤转移的作用。但是,硝呋齐特的水溶性较差,目前需要有机溶剂助溶后才能腹腔注射(鼠)。聚合物胶束作为药物传递系统的载体,可以增加药物的溶解度,提高药物稳定性,降低其毒副作用,同时还可以通过增强渗透与滞留作用(Enhanced permeability and retention effect,EPR)起到被动靶向作用。虽然纳米胶束载药系统在抗肿瘤药物的靶向输送和肿瘤治疗方面有着独特的优势,但由于肿瘤转移灶体积小、数量多且高度分散在侵入器官内,即使是纳米载体也很难通过被动靶向分布到肿瘤转移部位。故基于纳米给药系统靶向肿瘤转移的药物输送也面临着严峻的挑战。因肿瘤微环境与正常组织有较大的差异,且肿瘤组织中生物蛋白酶过表达,近来有学者研究了一种新型刺激型敏感的纳米给药系统,即组织蛋白酶B酶敏感的给药系统,该给药系统装载的药物可以靶向输送至肿瘤部位,药物在肿瘤部位被释放出来,增强抗肿瘤药物的疗效,减轻了正常组织的损伤。本课题通过构建组织蛋白酶B敏感短肽桥接阿霉素与Diblock polyNHBoc-OEG聚合物构成酶敏型前药,并利用该前药纳米粒装载硝呋齐特,考察其联合抑制小鼠原位乳腺癌肺部转移的作用。本论文主要从以下三个部分开展了相关的研究工作。第一部分,酶敏型聚合物前药的合成和自组装。采取可逆加成-断裂片段转移(reversible addition-fragmentation chain transfer,RAFT)聚合反应合成酶敏型聚合物前药(Diblock polyDOX-OEG),用紫外分光光度计法测定聚合物中DOX的含量,用体积排阻色谱法(Size exclusion chromatograph,SEC)测定聚合物的分子量;采用薄膜水化法制备DOX/NFX载药胶束(Co-loaded micelle,CLM);利用芘荧光探针法测定聚合物的临界胶束浓度(Critical micelle concentration,CMC);根据NFX的包封率和载药量对投料比进行了优化;采用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)和纳米粒度及电位分析仪(Dynamic light scattering,DLS)分析和测定纳米粒的形态、粒径、Zeta电位及稳定性;并采用透析法考察CLM在不同释放介质中的酶依赖释药行为。结果:合成了聚合物Diblock polyDOX-OEG,DOX在聚合物中的质量分数为9.2%(w/w);聚合物的CMC为0.025 mg/ml;通过优化聚合物前药形成的胶束对NFX的包封率和载药量分别是65.4%和11.6%;载药胶束形态近似球形,平均粒径为131.33?6.0 nm,且36 h内胶束的粒径较稳定;CLM的释放呈酶依赖性,48 h内的累计释放率均达到90%以上。结果表明,合成的组织蛋白酶B依赖性聚合物能在肿瘤部位特异性释放DOX和NFX,可提高药物的疗效及生物利用度,减少对正常组织的损伤。第二部分,载药胶束的体外有效性考察。采用CCK-8法检测CLM对4T1小鼠乳腺癌细胞存活率的影响;使用流式细胞术和共聚焦显微镜法考察细胞对CLM的摄取及细胞凋亡率;采用划痕实验检测CLM对细胞愈合的抑制作用;利用小室(Transwell)实验检测CLM对转移和侵袭的抑制。结果:游离化药DOX、NFX及载药胶束CLM的IC_(50)分别为0.48μg/mL、1.74μg/mL、8.93μg/mL;4T1细胞能摄取CLM,且药物主要分布在细胞质内;CLM能显著诱导4T1细胞产生凋亡;CLM能有效的抑制4T1细胞的生长愈合、转移和侵袭。结果表明,制备的载药胶束CLM可有效杀伤癌细胞并抑制乳腺癌细胞的转移,且毒性较小、安全性较高。第三部分,载药胶束的体内药效学评价。采用4T1细胞构建小鼠原位乳腺癌自发肺转移模型与尾静脉注射细胞的乳腺癌肺转移模型,并对肿瘤小鼠进行药效学考察,也对小鼠心、肝、脾、肺、肾等重要器官进行了组织病理学考察(HE切片),还对肿瘤组织进行了免疫组化切片(Ki67、CD31、MMP-9、MMP-2)和TUNEL染色切片,针对肺做了CD11b/Gr1的免疫荧光切片;并在原位乳腺癌自发肺转移模型上考察了CLM的离体器官分布情况。结果:通过离体器官成像发现CLM尾静脉给药36 h后在肿瘤部位蓄积量最大,且在肺部也有分布;CLM在两种肿瘤模型动物上均明显抑制了肿瘤的生长,尤其是抑制肺转移作用显著;切片结果显示,给药组的Ki67、CD31、MMP-9、MMP-2的阳性细胞数量显著降低;CD11b/Gr1的免疫荧光切片显示,给药组未观察到髓系来源的抑制性细胞(Myeloid derived suppressor cells,MDSCs);TUNEL显示给药组诱导原位肿瘤细胞产生大量凋亡;HE切片显示给药组相较DOX组对心脏等主要脏器未见明显影响。结果表明,该给药系统因联合了抗转移药物NFX,不仅具有抗肿瘤作用,还能有效抑制乳腺癌的肺转移。综上所述,本文合成了酶敏型阿霉素聚合物前药并包载了抗乳腺癌转移药物硝呋齐特,提高了硝呋齐特的水溶性,且DOX的释放呈酶依赖性,聚合物胶束通过EPR效应增强了药物在肿瘤部位的分布。该药物传递系统展现了良好的抗乳腺癌生长和抗肿瘤转移的效果,且安全性良好,有望为设计安全、有效的新型抗乳腺癌生长和抗肿瘤转移药物传输系统提供新的思路和新的方法。
【图文】：

形成机制,聚合物,结构示意图,胶束

第 1 章文献综述和常用。因其粒径较小，不易被网状内皮细胞吸收及肝、肾排泄，，延长了药物在血液里的循环时间，还有利于纳米药物在肿瘤组织的蓄积[39-40]。目前，聚合物胶束作为给药体系具有以下优势：(1) 增加药物的溶解度，提高生物利用度；(2) 在增强药物的稳定性的同时降低毒副作用；(3) 通过增强渗透与滞留作用起到被动靶向的作用；(4) 通过受体配体结合增加主动靶向性等。因此，聚合物胶束在作为药物载体和靶向治疗肿瘤方面已成为现今的研究热点，且在一定程度上取得了很大的进展。

示意图,胶束,包埋,药物

的同时加入到水中，亲水段会逐渐进入水相，束，然后加热使得有机溶剂蒸出。聚合物胶束中的方法主要有三种。第一种是物第三种是静电作用法。物理包埋法是药物和聚可被裹进聚合物胶束疏水内核中，其示意图如围广，主要有透析法、水包油乳化法、直接溶结合法是药物分子和聚合物疏水段基团发生化聚合物上，从而有效的控制药物的释放速度，其等[60]首先提出了将药物化学键入聚合物材料。物稳定性更好，可以避免药物发生突释，且此免肾排泄及网状内皮系统的吸收，提高药物的与带相反电荷的聚合物胶束疏水段通过静电作内。1995 年，HARDA 等[61]首先提出该方法，此稳定。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943;R965

【参考文献】