【摘要】：研究背景及目的心肌重构是慢性心力衰竭发生发展的主要病理生理过程,是许多严重心血管疾病发展为心力衰竭的最后共同通路。尽管目前治疗心血管疾病的药物和手段有多种,死亡率有所下降,但心源性猝死的比重却持续增加。心肌重构包括结构重构和电重构,其中心肌电重构引起的离子通道电流异常是诱发恶性心律失常及心源性猝死的主要原因。阐明心肌电重构的细胞与分子机制,对于发现电重构的潜在治疗靶标,以及控制恶性室性心律失常的发生意义重大。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,它参与心肌重构的多个方面,GSK-3β是重要的心肌肥厚负性调节信号分子,对心肌细胞凋亡有重要的调节作用,而且在血管组织中能促进血管增生,由于它具有一定的促凋亡能力,因而也可以作为提高缺血后心肌存活率的治疗靶点。近年发现,GSK-3β对多种离子通道有作用,但是这些文献主要集中于GSK-3β对神经细胞离子通道的作用,而其对心肌细胞中离子通道的影响未见有报道,并且它在心肌电重构有着怎样的作用也未见阐明。本课题拟建立大鼠心肌梗死(myocardial infarction,MI)模型和大鼠心肌细胞系H9C2缺氧模型,观察GSK-3β抑制剂SB216763对心肌梗死大鼠心肌组织、心脏功能和QT间期的影响,筛选GSK-3β参与调节的离子通道,并进一步通过大鼠H9C2心肌细胞缺氧模型对筛选通道进行验证。为解释心肌损伤后心肌电重构的分子机制以及心律失常的防治提供新思路和新靶点。研究方法1.大鼠心肌梗死模型的建立:采用冠状动脉左前降支(LAD)结扎术建立急性心肌梗死模型,手术全程心电监护,手术后II导联有ST段明显的抬高,则模型建立成功。2.分组和给药:雄性8周龄SD大鼠平均分为3组(2天组每组各10只,7天组每组各11只):假手术组(Sham),手术组(MI),给药组(MI+SB)(术前1小时,GSK-3β抑制剂SB216763,尾静脉注射给药,0.6 mg·kg~(-1)·d~(-1),在2天组中,每24h后给一次药,2天后处死;在7天组中,每24h后给一次药,连续给药7天后处死);Sham组只手术不结扎,MI+SB组同MI组处置方法。3.观察SB216763对大鼠心肌梗死的影响:采用HE染色、Masson染色、心电图、超声心动图、血清心肌酶的方法检测SB216763对大鼠心脏组织形态、纤维化、心功能以及QT间期的影响,并采用qPCR方法对影响QT间期的离子通道进行筛选,进一步采用qPCR和Western blot的方法对筛选出来的离子通道在mRNA和蛋白水平上进行验证。4.观察SB216763对缺氧H9C2细胞活性和钾离子通道表达的影响:使用Research Science AW400TG细胞工作站建立细胞缺氧模型。分组和给药:H9C2分为7组:NC(正常)、缺氧组(6h、12h、24h)、SB216763预处理组(SB/6h、SB/12h、SB/24h)。预处理组均采用10μM GSK-3β抑制剂SB216763预处理1h后再进行缺氧的方法处理,根据所筛选出的12h时间点检测SB216763对Kir2.1的蛋白表达水平的影响。结果1.GSK-3β抑制剂SB216763对大鼠心肌梗死后心肌组织形态和纤维化的保护作用HE染色结果显示,MI组细胞有空泡化和炎性浸润发生,7天的程度较2天更加明显,所对应的同期的MI+SB组均可以降低细胞损伤的恶性程度。术后Masson染色结果可见,术后组2天和7天MI组胶原纤维增生,比Sham组的纤维化程度明显加重,(P0.001,P0.01),所对应的MI+SB组较MI组皆有所减轻(P0.01,P0.05)。2.GSK-3β抑制剂SB216763减轻大鼠心肌梗死后心功能的损伤与Sham组相比,MI组在心梗后2天心脏功能受到损害,LVEF和LVFS显著降低(LVEF:P0.01,LVFS:P0.01),同MI组相比,MI+SB组改善了LVEF和LVFS的不良后果(LVEF:P0.05,LVFS:P0.01)。与Sham组相比,MI组在心梗后7天心脏功能受到损害(LVEF:P0.001,LVFS:P0.01),同MI组相比,MI+SB组改善了LVEF和LVFS的不良后果(LVEF:P0.05,LVFS:P0.05)。3.GSK-3β抑制剂SB216763减少大鼠心肌梗死后血清LDH、cTn-I的水平术后2天的动物血清中,MI组的心肌酶LDH显著升高,cTn-I无显著升高(LDH:P0.001,cTn-I:P0.05),同MI组相比,MI+SB组LDH显著降低,cTn-I无显著降低(LDH:P0.001,cTn-I:P0.05)。术后7天的动物血清中,同Sham组相比,MI组心肌酶LDH、cTn-I显著升高(LDH:P0.001,cTn-I:P0.001),而MI+SB组LDH、cTn-I比MI组显著降低(LDH:P0.001,cTn-I:P0.001)。4.GSK-3β抑制剂SB216763缩短大鼠心肌梗死后心电图的QT间期心电图仪Ⅱ导联测量三组大鼠手术前、手术后和处死前三个时间点的心电图,并计算心率(heart rate,HR)、QT间期和QTc。术前各组之间HR、QT、QTc并未明显差异,术后MI组出现异常波形,ST端抬高,表明心肌梗死手术模型造模成功;术后2天和7天的结果均显示,MI组和Sham组相比,HR加快,QT、QTc均明显延长,MI+SB组和MI组相比,HR减慢,QT和QTc均缩短。5.GSK-3β抑制剂SB216763对心肌梗死大鼠Kir2.1 mRNA(KCNJ2)和蛋白表达水平的降低具有上调作用在大鼠心肌梗死后2天和7天检测各组动物心肌组织缺血区SCN 5A(Nav1.5)、KCND2(Kv4.2)、CACNA1C(Cav1.2)、KCNQ1(K_V7.1)、hERG(K_V11.1)、KCNJ2(Kir2.1)的mRNA表达水平。结果显示,心肌梗死后,SCN 5A(Nav1.5)、KCND2(Kv4.2)、KCNQ1(K_V7.1)、hERG(K_V11.1)、KCNJ2(Kir2.1)mRNA表达水平下降,采用B216763预处理后,MI大鼠心肌组织中KCNJ2的表达上调,其余离子通道的mRNA水平无显著变化(P0.05)。Western blot结果显示,同Sham组相比,MI组Kir2.1蛋白表达水平显著降低(P0.01),MI+SB组同MI组相比,Kir2.1表达升高(P0.05)。6.10μM SB216763对H9C2细胞活性的影响用10μM浓度的GSK-3β抑制剂SB216763作用于H9C2细胞培养不同时间后,结果显示,同NC组相比,在此浓度下的SB216763对H9C2细胞培养6h、12h、24h、48h不同时间点的细胞活性没有影响。7.GSK-3β抑制剂SB216763减少缺氧诱导的H9C2细胞后cTn-I的释放量细胞分组处理后,收集细胞上清进行cTn-I检测,同NC相比,缺氧6h、12h、24h的H9C2细胞cTn-I释放显著增加,分别为(P0.01,P0.01,P0.001),抑制剂组在12h时能够显著降低cTn-I的释放(P0.01)。8.GSK-3β抑制剂SB216763能减弱缺氧H9C2细胞Kir2.1蛋白的降低同NC组相比,在缺氧12h之后,Kir2.1蛋白表达水平显著下调(P0.01),SB216763预处理之后,Kir2.1蛋白表达上调(P0.05);结论1.GSK-3β抑制剂SB216763能缓解大鼠心肌梗死后心功能损伤;2.GSK-3β抑制剂SB216763能上调大鼠心肌梗死后钾离子通道KCNJ2/Kir2.1的mRNA和蛋白水平的表达;3.在H9C2细胞水平,GSK-3β抑制剂SB216763对缺氧12h诱导的钾离子通道Kir2.1的表达降低具有上调作用。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965
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