重组人骨形态发生蛋白10（rhBMP10）的表达纯化和活性评价

发布时间：2020-03-23 21:59

【摘要】：诱因复杂的心力衰竭(Heart failure,HF)是心脏疾病发展的终末阶段,其中药物源性导致的心力衰竭占有一定比例。由于心脏器官的重要性、不可再生和难以修复的特征,规避药物对心脏损伤的新药研究,以及保护心脏的药物开发一直是药物设计的重要工作。研究室前期通过国际合作研究,发现骨形态发生蛋白10(Bone morphogenetic proteins 10,BMP10)具有促进和调节心脏组织的胚胎发育和出生后的生长发育作用。本文通过生物制备获得高活性的重组人BMP10(recombinant human BMP10,rhBMP10),通过体内功能研究评价了rhBMP10对药物源性心力衰竭发生的保护作用,主要结果如下:(1)构建rhBMP10表达质粒,并将其稳定转染至CHO-S细胞中,获得稳定高表达rhBMP10的CHO-BMP10单克隆细胞株。将human BMP10 cDNA序列中的EcoRI酶切位点(GAATTC)同义突变为GAGTTC,并插入至pMH3质粒的多克隆位点。用电转染的方式获得稳定转染的CHO-BMP10细胞,并使用Dot blot和Western blot验证了CHO-BMP10单克隆细胞株可以稳定表达rhBMP10。筛选获得的CHO-BMP10单克隆细胞株具备了作为本文后续研究工作中的起始出发细胞的要求。(2)将CHO-BMP10细胞株悬浮驯化,进行批次流加培养,使用Q柱和分子筛对培养上清进行纯化,获取纯化的rhBMP10并进行体外活性检测。悬浮驯化~10 d后,悬浮培养的CHO-BMP10细胞可以实现24 h倍增。在批次流加培养中,CHO-BMP10细胞的最大密度达到9.1×10~6 cells/mL,培养结束时,rhBMP10在培养上清中的累积浓度为35.3 mg/L。纯化后所获得的rhBMP10纯度达到95%以上,收率为49.8%。对纯化所得的rhBMP10的结构特征进行分析,考马斯亮蓝染色结果包括~116 kDa、~68 kDa、~43kDa和~26 kDa四个条带,分别为全长二聚体、部分切割二聚体、前导肽单体和生长因子结构域二聚体。验证了使用Furin体外酶切以获得N端一致的生长因子结构域二聚体的可行性。利用从Id1基因中分离的一组BRE序列(BMP responsive element,BRE),构建了能够特异性响应BMP10刺激的pGL6-BRE-Luc质粒,并验证了我们所表达的rhBMP10具有较高的生物活性。通过批次流加培养和两段式控温,使得高生物活性的rhBMP10在培养上清中大量积累,为下一步体内实验提供必要的材料。(3)利用多柔比星(Doxorubicin,DOX)构建了小鼠心力衰竭模型,并对其造成的心脏功能和器质性变化进行检查。DOX模型小鼠的射血分数(Ejection fraction,EF)为73.1±3.8%,显著低于对照组的84.6±2.4%和rhBMP10处理组的82.6±5.6%。DOX模型小鼠心脏组织切片的Masson’s染色出现了心肌纤维化的组织,同时最小肌纤维直径为11.3μm,而DOX+rhBMP10联合给药组的心肌组织未见大面积纤维组织,最小肌纤维直径为12.3μm。DOX模型小鼠心肌组织中cPARP水平较对照组和DOX+rhBMP10联合给药组明显升高。TUNEL检测中心肌细胞凋亡比例达到0.196%,显著高于对照组中的0.014%和DOX+rhBMP10联合给药组中的0.036%。此外,DOX模型小鼠的血清乳酸脱氢酶、肌酸激酶、cTroponin I和Myoglobin水平较对照组和DOX+rhBMP10联合给药组显著升高。实时荧光定量PCR结果显示,与线粒体功能相关的Ppargc1a、Esrra、Sdha和Nudfa3等基因的转录水平在DOX模型小鼠的心肌组织中出现了明显下调,而DOX+rhBMP10联合给药组中上述基因的转录水平均显著高于DOX模型小鼠。上述结果显示,rhBMP10能够减轻由DOX引起的心脏功能和器质性损伤。本研究构建了编码human BMP10 cDNA的pMH3质粒,并稳定转染至CHO-S细胞中,筛选获得了稳定高表达rhBMP10的CHO-BMP10细胞株。通过3 L摇瓶批次流加培养累积产物,并探索了rhBMP10的纯化条件,分析了其结构特征。通过高剂量多次DOX注射构建了DOX诱导的小鼠心脏病模型,并使用超声心动图、Masson’s染色、实时荧光定量PCR、Western blot和TUNEL等方法证明rhBMP10在减轻DOX引起的心脏损伤方面的积极作用。
【图文】：

示意图,动物模型,示意图

底面后室温摇床孵育 15min，待细胞完全裂解后，将裂解物吸出，移至置于-80℃备用；取白底 96 孔板，每孔加入 30 μL 裂解物，用排枪向每孔加入 80 μL LA标仪测定发光值（1 s）；取出孔板，进行数据分析处理。物分组以及 DOX 心肌损伤小鼠模型的建立雄性健康 C57 小鼠随机分为 4 组，其中两组每组 15 只（Saline 组，，rhB余两组每组 20 只（DOX 组，DOX+rhBMP10 组）。在实验开始前 3 天，X 每天注射 PBS 200 μL；rhBMP10 组和 DOX + rhBMP10 组每天注射 2（2 μg），直至第五周结束。Saline 组和 rhBMP10 组每周注射一次 PBS 组和 DOX + rhBMP10 组每周注射一次 DOX（5 mg/kg），共 5 次。第五随机选取 6 只动物检测超声心动图；随后处死动物，分离血清检测心肌酶抽提 RNA 进行实时荧光定量 PCR 分析转录水平差异；抽提蛋白进行 W蛋白水平差异；组织切片 Masson·s 染色观察纤维化情况；TUNEL 检测凋

点突变,条带,目的,线性化

将突变位点两边的片段扩增并电泳割胶回收（图3-1-A）。将回收产物和两端引物（FL-5·和 FL-3·）一起进行 PCR，15cycles 后制样电泳，凝胶在紫外下可见一条清晰的目的条带和一条模糊的非特异性条带（图 3-1-B）。将位于~1,300 bp 的目的条带切胶回收后，再用两端引物进行扩增，可在~1,300 bp 位置得到一条清晰的目的条带（图 3-1-C）。使用 EcoRI 和 NotI 限制性内切酶在 37℃酶切后，进行 1%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶在紫外下可见位于~8,000bp 的线性化空载质粒，以及位于~1,300 bp 的原装载片段（图 3-1-D）。将 PCR 扩增所得目的片段用 EcoRI 和 NotI限制性内切酶在 37℃酶切以获得黏性末端，与酶切后的线性化空载质粒在 22℃使用 T4Ligase 连接 30min 后
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R915;R96

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