注射用鼠神经生长因子生物学活性检测方法的研究

发布时间：2020-03-24 03:48

【摘要】：神经生长因子(nerve growth factor, NGF)是一种神经营养因子,具有促进神经元胞体存活、轴突定向再生和髓鞘生成的作用。目前,国际上通用的NGF活性测定方法主要有鸡胚背根神经节培养法和大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株(PC12细胞)培养法两种。传统的鸡胚背根神经节法比较经典,但方法操作比较繁琐,检测结果易受实验操作人员主观判断的影响,只能用作定性和半定量评价。PC12细胞培养法是基于NGF对PC12细胞分化的诱导作用。PC12细胞膜上有NGF受体,受生理水平NGF的诱导,PC12细胞停止分裂,长出神经突起,分化成具有交感神经元特性的细胞。分化的PC12细胞量与NGF活性间具有一定线性关系,可用于评价NGF的活性。本论文的目的是建立并优化用PC12细胞测定NGF活性的检测方法。主要包括：(1)PC12细胞培养方法的优化。包括NGF的稀释倍数、细胞的接种密度、细胞悬液的清洗次数、细胞的培养时间、染色液的染色时间。实验结果表明：在无血清培养条件下,NGF倍比稀释,最佳细胞接种密度为(3-4)*104／孔,最佳清洗次数为2次,最佳培养时间为48h,最佳染色时间为4h。利用优化后的培养方法分别测定了两个不同生产批次的NGF生物活性,变异系数均小于15%。(2)方法学验证。对优化后的PC12细胞培养法进行了方法学验证,包括方法准确性、精密度、线性测定范围、抗干扰能力等。抗干扰能力主要考察辅料甘露醇和人血白蛋白对NGF活性的影响。实验结果表明,本论文建立的改良PC12细胞培养法用于注射用鼠NGF活性分析,方法抗干扰能力强,辅料对NGF活性测定没有明显影响；方法准确度与精密度良好,回收率为80%-120%,变异系数10%；线性测定范围较宽1-100AU/ml,线性回归方程为：y=-0.873/[1+(x/17.977)2.092]+1.350。对多批次武汉海特生产的注射用鼠NGF活性测定结果表明,所建立的方法实用性良好。
【图文】：

细胞浓度,吸光值,曲线

培养时间为48h,染色时间为4h,考察细胞接种密度对PC12细胞检测NGF活性方法的影响。不同细胞密度下所测得的吸光值如表5所示，四参数曲线拟合如图5所示，检测结果显示：细胞浓度在2xl05/ml时所的的标准曲线相关系数好，曲线平滑，各点分布均匀，曲线更为典型，故细胞浓度选择2xl05/ml来进行活性测定。表5不同细胞接种密度下的吸光值NGF剂量细胞1X1 OVml 细胞2x 1 oVml 细胞3x 1 oVmlAU/ml 平均吸光值平均吸光值平均吸光值200 1.109 1.385 1.396100 1.098 1.377 1.33350 0.981 1.239 1.31225 0.548 0.981 1.02312.5 0.318 0.548 0.7816.25 0.254 0.318 0.5703.125 0.219 0.211 0.4941.5625 0.109 0.201 0.3120.7813 0.065 0.198 0.16522

曲线,次数,细胞,吸光值

细胞180^11，培养时间为48h，，染色时间为4h,考察细胞清洗次数对PC12细胞检测NGF活性方法的影响。不同清洗次数下所测得的吸光值如表6所示，四参数曲线拟合如图6所示，检测结果显示：清洗2次和3次，其相关系数都达标，但是细胞清洗3次的细胞状态不及清洗2次的状态好，所得的标准曲线信噪比较差，故对细胞清洗2次作为实验条件的确立。表6不同细胞清洗次数下的吸光值NGF剂量AU/ml 细胞清洗2次平均吸光值细胞清洗3次平均吸光值24
【学位授予单位】：湖北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R927.1

【参考文献】