地塞米松PLGA磁性微球的制备与临床前药效学研究

发布时间：2020-03-24 12:15

【摘要】：目的:制备地塞米松PLGA磁性微球,考察其外观、跨距、产率、包封率、载药量、磁响应性等参数;考察其体外释放的代谢模型以及稳定性;考察其生物相容性;考察其在大鼠慢性炎症模型是否成功及造模后局部注射地塞米松不同剂型后配合或不配合磁疗的治疗方案,观察其局部外观、机械痛阈及病理切片,以评估其疗效。方法:(1)地塞米松PLGA磁性微球通过乳化-溶剂挥发法制备,采用光学显微镜观察其粒径分布,HPLC方法检测其产率、包封率、载药量,用4000GS的外部磁场来观察其磁响应性。(2)体外释放实验:分别精密称取投料比为1:3,1:4,1:5的地塞米松PLGA磁性微球各10mg,分别置于具塞烧瓶中,其中放入50ml的PBS溶液(磷酸缓冲盐,PH=7.4)。将烧瓶放入恒温水浴震荡仪中,水位超过PBS溶液平面,震荡条件:36-37℃,100-120 次/分。在 0.5h,1.0h,1.5h,2.0h,2.5h,3.0h 之后每间隔24小时,采取上清液,直至第14天。每次移取样本2ml,每次采样后等量填充,所采集样本储存于4℃冰箱保存。(3)稳定性测试:将不同投料比的微球(n≥500)分别置于EP管中,并将其放入4-8℃的冰箱中3个月,分别在第0、1、2、3月的第1日观察其物理特征(光镜下粒径及外观)是否有改变,并同时使用前述HPLC方法检测其载药量。(4)体外溶血实验:将空白PLGA磁性微球置于已配制不同质量浓度的大鼠去纤维的红细胞悬液与生理盐水/蒸馏水的混合物样品中混匀,置于恒温水浴震荡仪中孵育3h,水温为36-37℃。将上述处理的受试样品离心,3000r/min,5min,留取上清液,室温静置30min。以阴性对照上清液为空白,根据540nm处光谱扫描得出的吸光值及溶血率。(5)体内血液相容性:取3只SD大鼠,分别称量体重,将供试品母液根据大鼠每100g体重注射0.8ml(高剂量),0.5ml(中剂量)及0.2ml(低剂量)计算注射剂量,分别经尾静脉注射大鼠体内。分别于注射前及注射后0.5h,6h,12h,24h取血0.5ml,置于抗凝管(紫色)并行血常规检查。(6)组织相容性实验:大鼠七氟醚吸入麻醉后,剃除左侧背部的毳毛,实验组皮下注射供试品母液1ml,对照组皮下注射1ml生理盐水。第10天及30天后取注射部位皮肤及皮下组织做HE染色。(7)大鼠足底慢性炎性模型构建:SD大鼠40只,220-250g,七氟醚麻醉后左后肢足底分别注射0.1mlCFA溶液。在之后2、4、6、8、10天观察其外观,用Von-Frey纤维丝测量机械痛阈,并在第10日在麻醉下取患足病理行HE染色。(8)微球治疗模型大鼠的药效评价:将36只模型大鼠分为6组,分别为微球组、微球+磁疗组、地米组、地米+磁疗组、阳性对照组、磁疗组,每组6只。分别注射地塞米松PLGA磁性微球(1:4)/地塞米松磷酸钠注射液,按照分组加或不加磁疗。在之后2、4、6、8、10天观察其外观,用Von-Frey纤维丝测量机械痛阈,并在第10日在麻醉下取患足病理行HE染色。结果:(1)地塞米松PLGA磁性微球,投料比分别为1:3,1:4,1:5的微球平均直径(跨距,S1)分别为(27.47±8.78)um,(29.66±10.02)um,(30.14±11.2)um。产率(S2)分别为(87.02±2.25)%,(87.25±3.14)%,(84.00±5.53)%;包封率(S3)分别为(76.44±3.11)%,(78.89±2.42)%,(71.33±5.60)%;载药量(S4)分别为(33.09±1.89)%,(30.33±2.01)%,(24.29±1.78)%;求和值(S)分别为(168.55±3.62),(167.47±4.15),(149.48±4.21)。以上微球表面光滑圆整,大小均一,分散性好,通针率高。(2)投料比为1:3,1:4,1:5的地塞米松PLGA磁性微球的体外释药模型分别为 Q=22.313In(t1/2)+28.651(R2=0.949),Q=4.0844t1/2+6.6602,(R2=0.977),Q=5.212t1/2+12.481,(R2=0.975);其第 2 日累计释放分别为 79.12%,32.91%,40.33%,第 7 日的累计释放率为 82.61%,62.74%,76.04%,第 14 日的累计释放率为86.34%,66.99%,97.85%。(3)稳定性测试:置于4-8℃冰箱后,其载药量及粒径无明显变化。(4)体外溶血实验:1mg/ml,2mg/ml,4mg/ml的样品吸光度分别为0.006,0.011,0.032;溶血率分别为0.5%,1.2%,3.3%。(5)体内血液相容性:与给药前血常规比较,高、中、低剂量组别的大鼠的注射后0.5h,6h,12h,24h的白细胞,红细胞及血小板的计数的变化均在正常范围内,无统计学意义。(6)组织相容性:大鼠注射部位病理切片(HE染色)第10天在40x10倍的视野中有少量炎症细胞,第30天炎症细胞较前增多,并且有纤维细胞增生及包裹。但与对照组比较无明显差别。(7)大鼠慢性炎症模型的构建:大鼠患足外观红肿,机械痛阈显著降低,病理(HE染色)可见大量炎性细胞浸润。(8)微球治疗模型大鼠的药效评价:微球(+磁疗)组与地米(+磁疗)组的效果比较,前2日的机械痛阈无统计学差异,第4-10日,微球+磁疗组的机械痛阈明显高于其他组别。病理切片提示与阳性对照比较除了磁疗组外,其余各组的炎性细胞均明显减少。改善程度于微球组与微球+磁疗组最为明显。结论:地塞米松PLGA磁性微球有一定的缓释性、良好的生物相容性及针对慢性炎症导致的慢性疼痛有明显改善。
【图文】：

图２邋．邋ＰＬＧＡ／ＰＬＡ的电镜下形态逡逑

图２实验组大鼠注射第３０天皮肤表现逡逑
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943;R96

【参考文献】

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1 魏爽;韩奇;郑拥军;王祥瑞;;上海市居民慢性疼痛患病现状调查[J];中国疼痛医学杂志;2015年06期

2 张恒，

本文编号：2598303