多酚化合物LM49对RAW264.7巨噬细胞极化的影响及其机制的初步探究

发布时间：2020-03-24 21:51

【摘要】：研究背景:2,4’,5’-三羟基-5,2’-二溴二苯甲酮(LM49)是课题组在对海藻多酚类化合物进行结构优化的过程中,得到的新型多酚结构化合物。动物实验证实LM49可明显改善急性肾盂肾炎大鼠的肾功能,增加大鼠血清中的抗炎因子IL-10的含量,降低炎症因子IL-1β和IL-6的含量,表明了LM49对细菌性炎症具有抗炎作用。但是,具体的抗炎机制尚不明确,RAW264.7细胞为体外研究炎症反应的靶细胞,因此本文主要探讨LM49对RAW264.7巨噬细胞的影响,从而明确LM49发挥抗炎作用的分子机制。目的:鉴于巨噬细胞的极化参与机体调控炎症反应的进程,本课题旨在探讨LM49抗炎活性与巨噬细胞极化的关系,且通过体内与体外实验评价LM49对巨噬细胞极化的影响,并初步探讨LM49调控巨噬细胞极化的机制。方法:第一部分多酚化合物LM49对LPS+INF-γ诱导的RAW264.7巨噬细胞极化的影响1.MTT法检测LM49对RAW264.7细胞活力的影响。2.Griess法检测LM49对LPS+INF-γ诱导的RAW264.7巨噬细胞分泌NO产量的影响。3.流式细胞术检测LM49对LPS+INF-γ诱导的RAW264.7巨噬细胞膜表面分子CD16/32和CD206表达的影响。4.Western-blot检测LM49对LPS+INF-γ诱导的RAW264.7巨噬细胞分泌i NOS和Arg-1蛋白表达的影响。5.RT-PCR检测LM49对LPS+INF-γ诱导的RAW264.7巨噬细胞Arg-1、i NOS、CD206、CD86、CD163、FIZZ、IL-6、TNF-α、IL-10、MCP-1和IL-12 m RNA表达的影响。第二部分LM49对LPS+INF-γ诱导的RAW264.7巨噬细胞极化机制的初步探讨1.RT-PCR检测LM49对LPS+INF-γ诱导的RAW264.7细胞IRF-4、IRF-5、KLF4、SOCS1、SOCS3、NF-κB、STAT1、STAT3、STAT6、TLR4、Myd88、JAK1、JAK2和JAK3 m RNA表达的影响。2.Western-blot检测LM49对LPS+INF-γ诱导的RAW264.7细胞TLR4、Myd88和NF-κB蛋白表达的影响。3.Western-blot检测LM49对LPS+INF-γ诱导的RAW264.7细胞SOCS1、JAK2、p-JAK2、STAT1和p-STAT1蛋白表达的影响。4.Western-blot检测LM49对LPS+INF-γ诱导的RAW264.7细胞JAK1、p-JAK1、JAK3、p-JAK3、STAT6和p-STAT6蛋白表达的影响。第三部分LM49对LPS诱导的急性肝损伤中肝脏Kuffer细胞极化的影响1.微孔法检测LM49对LPS诱导的急性肝损伤小鼠血清中的AST和ALT活力的影响,ELISA检测小鼠血清中的IL-6和TNF-α含量的影响。HE染色检测LM49对LPS诱导的急性肝损伤小鼠的肝脏组织炎症反应的影响。2.免疫组化检测LM49对LPS诱导的急性肝损伤小鼠肝脏组织中Arg-1的表达影响,流式细胞术检测肝脏巨噬细胞(KCs)中CD16/32和CD206的表达。3.Western-blot和RT-PCR检测LM49对LPS诱导的急性肝损伤小鼠的KCs细胞中i NOS和Arg-1表达水平的影响。结果:1.LM49在0~30μmol·L-1浓度下对RAW264.7细胞无明显毒性,后续实验选择的剂量为5μmol·L-1,10μmol·L-1,20μmol·L-1。LM49呈剂量依赖性的抑制LPS+INF-γ诱导的RAW264.7细胞上清液中NO的表达。LM49显著抑制i NOS的蛋白表达和诱导Arg-1的蛋白表达,且呈一定的剂量依赖性。2.LM49抑制LPS+INF-γ诱导的RAW264.7细胞M1型标志物CD16/32的表达和诱导M2型标志物CD206的表达,且呈剂量依赖性;LM49抑制LPS+INF-γ诱导的RAW264.7细胞中i NOS、IL-6、TNF-α、CD86、MCP-1和IL-12的m RNA表达,诱导Arg-1、CD206、CD163、FIZZ和IL-10 m RNA的表达。3.LM49抑制LPS+INF-γ诱导的RAW264.7细胞中IRF-5、JAK2、SOCS3、STAT1、TLR4、Myd88和NF-κB m RNA的表达,上调细胞中IRF-4、KLF4、SOCS1、JAK1、JAK3和STAT6 m RNA的表达,但是,对STAT3 m RNA的表达没有明显的促进作用。4.LM49抑制LPS+INF-γ诱导的RAW264.7细胞中TLR4、Myd88和NF-κB蛋白的表达;LM49的高剂量组显著增加细胞中SOCS1的表达,抑制细胞中JAK2、p-JAK2、STAT1和p-STAT1蛋白的表达;LM49上调RAW264.7细胞中JAK1、p-JAK1、JAK3、p-JAK3、STAT6和p-STAT6蛋白的表达。5.LM49可以显著降低LPS诱导的急性肝损伤小鼠血清中的AST和ALT的活性,对血清中的炎症因子IL-6和TNF-α也有显著的抑制作用。病理切片显示,LM49可明显减少LPS诱导的急性肝损伤小鼠肝脏中炎性细胞浸润。6.免疫组化结果显示,LM49可以显著性增加肝脏中M2标志物Arg-1的表达;流式结果显示,LM49可以显著性的增加M2标志物F4/80+CD206+细胞数目,减少了M1标志物F4/80+CD16/32+细胞数目;RT-PCR和Western-blot结果显示,LM49可以显著增加肝脏KCs细胞中Arg-1的表达,降低了KCs细胞中i NOS的表达。结论:1.LM49对LPS联合INF-γ诱导的M1型巨噬细胞有显著的抑制作用,同时可促进巨噬细胞向M2型极化。2.LM49通过对TLR4-Myd88-NF-κB和JAK2-STAT1通路的负向调控作用抑制M1型巨噬细胞极化;通过对JAK1/JAK3-STAT6通路的正向调控作用促进M2型巨噬细胞极化。3.LM49对LPS诱导的急性肝损伤小鼠具有肝脏保护作用,可能通过其促进肝脏巨噬细胞向M2型极化发挥其抗炎作用。
【图文】：

山西医科大学硕士学位论文以均数±标准差（ X±SD）来表示。采用 graphpad p验及 One-way ANOVA 比较各组内及组间差异。P <义。所有实验均重复进行 3 次。2 结 果 RAW264.7 巨噬细胞活力的影响 所示，，LM49 作用于 RAW264.7 细胞 24 h 后，在 0～264.7 细胞无明显毒性。在后续实验中，LM49 的

LPS+INF-γ诱导 RAW264.7 细胞上清液中 NO 的含量的影响 control 组（##P < 0.01），LM49 组 vs LPS/INF-γ组（*P < 0.0 LPS+INF-γ诱导的 RAW264.7 细胞膜表面分达的影响所示，LPS+INF-γ组与空白组比，可显著诱导 RAW；而 LM49 组与 LPS+INF-γ组相比，可显著抑制 L胞中 CD16/32 的表达，同时诱导 RAW264.7 中 CD2量依赖性。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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本文编号：2598909