抗肿瘤药物PEITC对热休克反应双重调控机制的研究

发布时间：2020-03-24 22:18

【摘要】：背景热休克反应(heat shock response,HSR)是生物体在外界某些刺激(如高热、氧化应激和重金属等)下,为维持自身稳态而激活热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)表达的保护反应。高表达的HSPs(如Hsp70,Hsp40等)通过帮助其它蛋白质进行正确折叠、转运或降解以防止蛋白质发生变性后在细胞内大量堆积从而破坏细胞自身的稳态。多项研究表明,热休克转录因子1(Heat shock transcription factor 1,HSF1)在多种肿瘤细胞中高表达,并与肿瘤的演进和不良预后密切相关,主要作用机制是通过增强其自身326位点的丝氨酸(S326)进行磷酸化,从而上调Hsp70、Hsp27等的表达后促进其下游靶基因c-myc,Ras,c-fos等的激活,导致细胞发生恶性增殖和凋亡抵抗。大量证据表明HSF1可作为一个很好的抗肿瘤靶点。近期研究表明HSF1调控HSP转录表达的同时也受HSP的反馈调节。其相对分子机制目前尚不完全清楚。其中广为研究的为Hsp70。热休克蛋白70是一种高度保守且普遍表达的HSPs家族,几乎存在于所有生物体中,受HSF1调控作用最强。应激诱导的Hsp70(由三个非常密切相关的旁系同源物编码:HSPA1A、HSPA1B和HSPA1L)属于Hsp70家族的成员之一。细胞可以通过响应高热、过氧化和pH值变化等应激条件而活化HSF1,进而诱导Hsp70高水平表达,进而维护细胞内蛋白质的稳定,降低细胞内蛋白毒性压力。已有研究指出HSF1的转录活性主要受HspA1A的负反馈调节。异硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate,PEITC)是一种天然存在十字花科蔬菜中的异硫氰酸酯。PEITC已被研究用于预防多种癌症,此外还在神经退行性疾病、心血管疾病和细菌感染发炎等方面发挥着保护作用。研究发现PEITC可以激活多种细胞保护途径,如由HSF1介导的热休克反应,并可引起细胞转化因子的变化。因此,我们设计并合成针对HSPA1A基因的gRNA(guide RNA),转染细胞后引导Cas9内切酶在HSPA1A基因组的特定位点进行酶切,在HSPA1A基因外显子的ATG前定点引入GFP的核酸序列,使得GFP基因的转录水平受控于HSPA1A启动子的活性;GFP核酸序列末尾的终止密码子TAA使得HSPA1A的翻译被阻断。将重组质粒转染Hela细胞,经抗生素加压筛选和流式细胞术分离,测序鉴定得到HSPA1A~(-/-)/GFP的重组单克隆细胞系,以此重组细胞为模型进行筛选调控HSF1/Hsp70的药物。鉴于HSF1与肿瘤的耐药、转移等恶性生物学行为密切相关。系统、精准地筛选调控热休克反应的药物就变得尤为重要。本课题旨在丰富能调控HSF1的化合物库并完善相关的分子机制研究。目的利用CRISSPR/Cas9基因编辑技术在宫颈癌细胞(Hela)的HSPA1A基因外显子的ATG前定点引入GFP的核酸序列。使得GFP基因的转录水平受控于HSPA1A启动子的活性,通过在GFP编码基因的3'末端添加终止密码子TAA使HSPA1A的翻译被提前阻断。以重组细胞Hela/HSPA1A~(-/-)/GFP为模型筛选调控热休克反应的药物并探索相关调控机制。方法和结果1.构建靶向人HSPA1A基因的CRISPR/Cas9 PX333-gRNA质粒和HSPA1A~(-/-)/GFP重组片段质粒。为提高gRNA的切割效率,我们在HSPA1A基因的起始密码子上下游各设计了2个gRNA位点。2.将质粒共转染宫颈癌细胞系(Hela),通过高速流式细胞分选系统(FACS)筛选得到荧光重组单克隆细胞,通过PCR,WB和FACS在DNA水平、蛋白水平、细胞水平验证基因重组结果。3.通过WB和FACS意外发现PEITC与热休克处理没有协同作用,PEITC反而拮抗由热休克介导的应激作用。4.通过核质分离,三聚体实验和CHIP检测PEITC处理下HSF1的转录活性状态。结果显示PEITC增强HSF1在热应激期间的活化水平。5.为了排除敲除HSPA1A对PEITC处理3~#重组细胞结果的影响,在同样处理条件下处理Hela细胞后进行核质分离,WB和RT-PCR结果比较。结果显示HspA1A反馈调节HSF1磷酸化状态。6.RNA免疫共沉淀(RIP)实验发现并证明HSF1能直接结合Hsp70的mRNA进行翻译调控;免疫共沉淀(Co-IP)实验发现并证明HSF1参与调控应激状态下核糖体的组装;PEITC影响HSF1在应激状态下与mRNA或核糖体的相互作用。结论PEITC是HSF1的激活剂;PEITC使HSF1在热应激期间持续活化并抑制下游靶蛋白的翻译;HspA1A负反馈调节HSF1的磷酸化状态,与HSF1共同参与调控应激状态下核糖体的组装及对Hsp70 mRNA的翻译。
【图文】：

模式图,重组片段,表达质粒,质粒

图 2.1 构建 PX333-HSPA1A-gRNA 表达质粒及 HSPA1A-/-/GFP 重组片段质粒。A: HSPA1A 重组基因结构模式图；B：Px333-gRNA 质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定，从左向右依次为：质粒空载 Px333 质粒 Bbs I酶切成单链，电泳时迁移速度变慢；而连入 gRNA 后单酶切位点被破坏，因此与原质粒迁移速度相同。gRNA 与 Px333 质粒成功酶连致使 Bbs I 酶切位点丧失；而空载仍会被酶切。C：HSPA1A-/-/GFP 同源重组片段的基因结构模式图。D: HSPA1A-/-/GFP 同源重组片段质粒的双酶切验证的琼脂糖凝胶电泳鉴定。2.2 获得 Hela/HSPA1A-/-/GFP 重组单克隆细胞系将 PX333-HSPA1A-gRNA 质粒，HSPA1A-/-/GFP 同源重组片段和 pBABE 质粒共转染 Hela 细胞，经过 10 μg/ml 嘌呤霉素加压筛选三天后，，富集三种质粒转染均阳性的细胞。43 ℃热休克处理 1 h，恢复正常培养 10 h 后通过高速流式细胞分选系统分选出GFP 荧光表达阳性的单细胞，将单细胞大量扩大培养。先冻一批细胞进行保种，再提取单克隆细胞的基因组 DNA 和总 mRNA，通过基因组测序和 RT-PCR 验证得到两株在

热休克,重组细胞,蛋白表达,表达水平

2.实验结果Western Blot 的结果进一步证明，3#和 4#细胞株在热休克（43℃，1h）处理，应用Hsp90 的特异抑制剂 17AAG（0.2 μM/L）或蛋白酶体抑制剂 MG132（5 μM/L）处理后，受 HSF1 调控的 HSPs 的蛋白表达均显著增多，其中 GFP 和 Hsp70 的表达水平剧烈升高，并且随 17AAG的刺激呈时间依赖性上调（2.2 图 C）；与 Western Blot 的结果一致，Real time PCR的检测结果显示，相同条件的热休克或 MG132处理后，3#和 4#细胞中 GFP 和 Hsp70 的 mRNA 的表达水平均显著升高。17AAG（0.2 μM/L）刺激 12h后，GFP 的 mRNA 水平达到峰值（2.2 图 D）。这些结果证明 3#和 4#细胞的 GFP 的基因和蛋白表达均与 HSF1 的转录活性相关；3#和 4#重组细胞能对不同的应激条件做出应答，表明重组细胞系的热休克应激反应系统能正常工作。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

【参考文献】