新型HIV膜融合抑制剂的设计及作用机制研究

发布时间：2020-03-29 14:17

【摘要】：自首例艾滋病(获得性免疫缺陷综合征,acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)患者在美国被检测发现以来,AIDS已成为一种严重危害人类健康的疾病。作为唯一一个被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于AIDS患者临床治疗的多肽膜融合抑制剂,恩夫韦肽(Enfuvirtide,T20,又称DP178)的发现开辟了利用多肽类药物控制HIV感染的新领域,在一定程度上改善了患者的生命质量,可作为“鸡尾酒疗法”高效抗逆转录病毒治疗失败的补救措施。但在随后的治疗研究过程中暴露的一些弊端,比如多次用药易产生耐药性、生物利用度低、对HIV-2抗病毒活性弱等,限制了 T20进一步的临床应用。T1249是继T20之后开发设计的第二代多肽膜融合抑制剂,弥补了 T20抗病毒过程中出现的不足,对HIV-1各亚型、HIV-2/SIV及T20耐药病毒株均具有较高的抗病毒活性。但随后由于制剂、分子量大等问题限制了 T1249进一步的研究应用。因此,更具临床应用价值的多肽膜融合抑制剂亟待研发设计。本课题聚焦T20多肽膜融合抑制剂,探讨其具体抗病毒作用机制,同时指导新型膜融合抑制剂的设计。首先,我们通过病毒单次侵染抑制实验及圆二色谱(circular dichroism,CD)实验证明了色氨酸富集区(tryptophan-rich motif,TRM)在 T20抗病毒活性及其与相应NHR结合形成六螺旋体(six-helixbundle,6-HB)结构的重要性;为了进一步探讨TRM在T20抗病毒活性中的作用,并研发设计更具潜在临床应用价值的膜融合抑制剂,我们随后用同样具有高度疏水特性且能与靶细胞膜发生相互作用的脂肪酸(软脂酸,C16)取代T20羧基端的TRM,从而获得新的脂肽LP-40。相比T20及早期报道的以T20序列为模板设计的脂肽DP-C16,LP-40无论是与NHR结合能力,亦或抗病毒活性都有明显提高。研究发现,不同于早期设计合成的作用于gp41 NHR疏水口袋“pocket”区的脂肽LP-11,在多肽序列与脂肪酸之间Linker的添加不仅没有因为增强多肽的灵活性而使其抗病毒能力增强,反而严重削弱,这表明,LP-40与LP-11可能以完全不同的模式同gp41 NHR发生相互作用。有趣的是,随后的研究发现,尽管LP-40抗病毒活性低于LP-11,但在HIV-1各亚型包膜蛋白介导的膜融合过程中却表现出强有力的抑制活性,而且两种多肽联合使用具有中等程度的协同作用,这一方面进一步表明两种多肽作用机制的不同,另一方面也表明,对于HIV-1来说,病毒进入靶细胞的机制与由其包膜蛋白介导的膜融合机制之间可能存在一定的差异,在患者体内,或许这两个过程并不是以完全相同的模式在介导病毒传播。此外,尽管LP-40在很多方面的特性优于其模板多肽T20,但其对T20耐药株及HIV-2病毒株依旧表现较弱的抗病毒活性。因此,受LP-40脂肽设计的启发,也为了克服T20、T1249及LP-40在抗病毒活性中的不足,我们以T1249序列为模板,同样用脂肪酸C16取代其羧基端的TRM序列,合成一新的脂肽LP-46。随后的实验结果表明,相比T20、T1249及LP-40,LP-46对HIV-1的抗病毒活性IC50值接近皮摩尔浓度,对HIV-2/SIV及T20耐药株也表现出极高的抗病毒活性。总之,我们的研究结果不仅提供了更具潜在临床应用价值的多肽膜融合抑制剂,而且以T20/LP-40为探针从新的角度进一步揭示了 HIV膜融合的分子作用机制。
【图文】：

结构图,病毒体,结构图

激活ＨＩＶ基因的转录并促进病毒ｍＲＮＡ的翻译；种顺式激活因子，能对ｅｎｖ和中顺式作用抑制序列去抑ｎｖ基因的表达，以合成相应的病毒结构蛋白；６．７ｚｅ／基因编码ｐ的表达有负调控作用，以推迟病毒复制；７．邋ｗｊ基因对ＨＩＶ并响游离ＨＩＶ的感染性、病毒体的产生和体内传播；８．邋基因ＨＩＶ的有效复制及病毒体的装配与成熟必不可少；９．邋ｖｐ／＊基因转录激活物，在体内繁殖周期中起一定作用。由上述这些调白在病毒基因组ＲＮＡ的转录、转录后加工、蛋白质翻译及分重要的作用。逡逑ｇｐ４１邋ｐ１７邋ｍａｔｒｉｘ逡逑

序列,缺失,序列,相互作用

独的Ｎ３９在ＰＢＳ溶液中以无规则卷曲构象存在，自身序列之间不能形成螺旋套螺逡逑旋结构构象，但添加同等浓度的Ｔ２０后，两者相互作用却可以形成典型的６－ＨＢ结逡逑构，该复合物在２０８邋ｎｍ和２２２邋ｎｍ均出现最大负峰值，ａ－螺旋含量百分比约占５２．０４邋％，逡逑Ｋ值约４２．０６邋°Ｃ，具有一定的结构稳定性。而ＴＲＭ序列的缺失导致Ｔ２０ＡＴＲＭ无逡逑法诱导Ｎ３９与之相互作用形成稳定的ａ－螺旋结构，严重影响复合物结构的稳定性。逡逑３．２邋Ｔ２０序列中的ＴＲＭ与ＮＨＲ相应位置上的ＦＰＰＲ序列之间存在一定的相互作用逡逑鉴于ＴＲＭ的缺失严重影响Ｔ２０与Ｎ３９结合形成稳定６－ＨＢ结构的能力，因此，逡逑我们进一步探讨ＴＲＭ具体作用靶点和机制。根据ＨＩＶ感染靶细胞的膜融合发夹结逡逑构模型及ＴＲＭ在ｇｐ４１结构中的位置（图４），我们推测Ｔ２０羧基端的ＴＲＭ对应的逡逑作用靶序列为ＦＰＰＲ序列。为了探宄ＦＰＰＲ序列在Ｔ２０与ＮＨＲ相互作用时扮演的角逡逑色，我们合成了另一个多肽，Ｎ３９ＡＦＰＰＲ，即氨基端缺失了邋ＦＰＰＲ片段的Ｎ３９多肽。逡逑随后，，我们使用等温滴定量热仪ＩＴＣ方法检测了邋ＦＰＰＲ序列的存在与否是否会影响逡逑Ｔ２０与Ｎ３９相互作用过程中的热动力学变化，即通过测定两种多肽相互作用时的吸逡逑热或放热来计算其亲和力常数（Ｋ）、化学反应量（ｎ）、焓（ＡＨ）和熵（ＡＳ）。逡逑Ｔｕｎｅ邋（ｎｕｉｉ）逦Ｔｉｍｅ邋（ｎｕｎ）逦Ｔｍｉｅ邋（ｎｉｍ）逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R91

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