重组凝血因子Ⅻ的构建及功能鉴定和两种新型抗凝药与人血清白蛋白结合位点初探

发布时间：2020-03-31 06:26

【摘要】：目的:利用毕赤酵母系统表达活性凝血因子Ⅻ催化结构域(Coagulation factor XII-Serine protease domain,FXII-SPD)及其功能鉴定。方法:蛋白质数据库中查询凝血因子Ⅻ催化结构域的cDNA序列并按照该序列合成,通过XhoI和SalI双酶切位点插入到pPICZαA质粒载体上,电转导入到感受态毕赤酵母X33菌株中进行表达。表达的重组蛋白用镍离子金属螯合亲和层析进行初步纯化,然后用分子排阻层析进一步纯化,用蛋白免疫印迹和高效液相色谱-质谱鉴定目的蛋白的表达情况,再进一步测定与其特异性生色底物S-2302的米氏常数来分析目的蛋白的活性,并检测其对血液中凝血过程的影响。结果:利用巴斯德毕赤酵母系统能表达rFXII-SPD(Recombinat coagulation factor XII-Serine protease domain,rFXII-SPD),表达量可达20mg/L;提取的rFXII-SPD纯度较高,未见其他杂带;表达的rFXII-SPD在体外具有酰胺分解活性和可以加速血浆中凝块形成。结论:1.在巴斯德毕赤酵母系统中顺利表达了rFXII-SPD蛋白。2.成功使用Ni ~(2+)-NTA亲和层析以及凝胶过滤方法纯化了表达的rFXII-SPD蛋白,提取的rFXII-SPD纯度较高。3.rFXII-SPD蛋白具有体外酰胺分解活性和促进凝血发生的作用。目的:初步探测人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)与两种新型抗凝药物(利伐沙班和阿加曲班)的结合位点。方法:1.制备HSA-新型抗凝药物(阿加曲班;利伐沙班)复合物并生长HSA-新型抗凝药物复合物晶体。2.用浸泡方法获取HSA-新型抗凝药物的二元复合物晶体,先生长单独的HSA晶体,将HSA晶体浸泡于含新型抗凝药物的池液中,使药物通过扩散进入到HSA晶体中,以形成HSA-新型抗凝药物复合物晶体。3.将获得的HSA-新型抗凝药物二元复合物晶体送去上海光源同步辐射中心进行X-ray衍射实验。4.解析HSA-新型抗凝药物复合物晶体结构。(1)构建模型:获得原始晶体数据后,采用CCP4的molrep程序,以PDB数据库中的HSA晶体结构为模板,运用快速旋转和平移函数寻找正确的原子模型。(2)修正结构:获得适合的模型后,采用Refmac和CNS以及p Henix程序对其进行修正,并确定抗凝药物的位置。(3)精修结构:一旦获得电子密度图和合适的坐标文件,再使用Coot和PyMOL程序对结构进行精修。结果:1.人血清白蛋白-阿加曲班二元复合物的结晶条件:31%~35%PEG3350,p H7.4 PB,H_2O。2.人血清白蛋白-利伐沙班二元复合物的结晶条件:31%~35%PEG3350,p H7.4 PB,H_2O。3.对收集到的人血清白蛋白-阿加曲班、人血清白蛋白-利伐沙班二元复合物共晶的结构数据进行解析,发现人血清白蛋白某些氨基酸附近有利伐沙班和阿加曲班电子云密度。结论:电子云密度提示,阿加曲班和利伐沙班可能与人血清白蛋白有结合。
【图文】：

6×His 标签）即构建出重组质粒 rFXII-SPD-pPICZαA（图1）。经上海博尚有限公司对重组质粒 rFXII-SPD-pPICZαA 的测序证实了 FXII-SPD 的阅读框是正确的（图 2）。

18图 2 蛋白序列比对（序列 1 为 uniprot 上查询的 Factor XII-SPD 的蛋白序列，，序列 2 为克隆测序翻译出来的 Factor XII-SPD 蛋白序列）3.2 蛋白表达与纯化目的蛋白经过小量表达鉴定，如图 3 所示，1、2、4 号菌液 含有目的蛋白条带且杂带较少；3 号菌液含有目的条带但同时含有较多杂带；5 号未诱导菌液未见目的蛋白表达。收集含有目的蛋白条带且杂带较少的洗脱液经将洗脱液浓缩后用分子排阻层析法进一步纯化，在 8.5 mL 和 12.8 mL 处出现了两个峰（图 4），分别代表聚集体和单体 rFXII-SPD 的峰，收集代表单体的目的蛋白。经 15%SDS-PAGE 分析见凝胶上只有一条分子量介于 25-35KD 之间蛋白区带，说明收集的蛋白纯度较高，且均一性良好。
【学位授予单位】：遵义医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;R96

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本文编号：2608702