内含肽介导的新型可溶性表达纯化系统建立及其在重组趋化因子CXCL9的应用研究

发布时间：2020-04-02 23:49

【摘要】：背景:趋化因子CXCL9(C-X-C motif chemokine 9)是缺乏ELR结构域的CXC趋化因子亚族之一,可趋化T淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞,在白细胞运输中起关键作用,作用于活化的CD4~+Th1细胞,CD8~+T细胞,IL-2活化的T淋巴细胞和NK细胞等。CXCL9在许多疾病中发挥重要作用,包括外部感染、肿瘤治疗、自体免疫性疾病、移植排斥反应等,最近报道CXCL9在肿瘤化疗中具有保护造血干细胞的作用。然而,CXCL9在大肠杆菌系统中表达易形成包涵体,通过变性复性过程获得,不仅增加纯化步骤,增大生产过程中的经济及时间成本,并且变性过程存在疏水区过度暴露的风险,蛋白空间结构改变可能导致最终产物的生物学活性较差。因此,可溶表达对提高大肠杆菌生产CXCL9的规模化生产具有关键意义。本研究中,我们探讨内含肽介导的CXCL9重组蛋白可溶性表达纯化系统建立及应用,对原有制备工艺进行优化,实现CXCL9的可溶性表达及高效纯化。方法:本研究中,我们借助低温诱导和内含肽系统实现CXCL9在大肠杆菌内的可溶性表达。采用具有C端自剪切功能的内含肽?I-CM,本课题构建了3种“标签+?I-CM+CXCL9”组合,以蛋白可溶性为主要判断标准,筛选最优组合。进一步优化温度表达条件后,选择Zbasic-?I-CM-CXCL937°C融合表达和25°C条件下低温诱导表达的产物进行纯化。我们根据目的蛋白的相关性质进行了一系列纯化方案探索,最终确定了“SP FF(阳离子交换色谱)→CHT I(陶瓷羟基磷灰石柱色谱)”的两步纯化策略。采用该策略,将可溶表达的CXCL9从细菌裂解上清中纯化出来:阳离子交换色谱作为第一步粗纯方法,用SP FF强阳离子交换介质纯化并浓缩。得到的洗脱产物超滤脱盐,第二步用CHT I精纯得到最终产品。为了与Zbasic-?I-CM促溶系统和低温诱导促溶对比,我们参照文献报道重复了包涵体的变复性工艺,37°C诱导得到的菌体裂菌后收集沉淀,用8 M尿素溶解后于pH 6.0稀释复性,再调节pH至7.2后上样,采用SP FF一步纯化得最终产品。结果:通过比较FATT、Fh8和Zbasic三个促溶标签,Zbasic-?I-CM-CXCL9融合表达策略在37°C下能够得到较优的可溶效率和较高的表达量。优化可溶表达条件后,发现25°C条件下低温诱导表达可以达到较好的单独CXCL9可溶性表达的最优产量。因此,我们分别采用Zbasic-?I-CM可溶表达系统、低温诱导表达系统、包涵体变复性表达系统进行CXCL9的纯化研究,并考察其效率。为了评价三种方法所得CXCL9产品的质量特征,我们建立了一系列包括考马斯亮蓝(SDS-PAGE)电泳分析,分子筛排阻色谱(SEC-HPLC)检测样品纯度,和超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-MS)质谱仪测定蛋白完整分子量的检测方法。结果显示纯化所得CXCL9产品纯度超过97%,结构完整,LC-MS相对分子量符合预测值。我们利用HUVEC细胞增殖实验检测终产品的活性,IC_(50)为4.13-8.33μg/mL,表明纯化所得的CXCL9均具有一定的生物学活性。Zbasic-?I-CM系统有效实现了CXCL9的高效可溶表达纯化,省时节能成本低廉,为开发新型的适用于更多细胞因子类药物生产的表达系统提供参考。
【图文】：

趋化因子,信号通路

CL9 简介构与分类mokines, chemoattractant cytokines）是一类小其分子量为 8-10 kDa，可作为化学诱导物引细胞的迁移。目前已发现将近 50 种趋化因子种 G 蛋白偶联跨膜受体。研究表明，趋化因作用，如白细胞表面的葡萄糖胺聚糖。白细用力在内皮细胞表面发生滚动运动，从而激信号通路上调，导致细胞骨架发生改变产生趋的相互作用，趋化因子可作用于多种生理及炎症反应，，肿瘤的形成及其转移等[2-4]。

趋化因子,结构示意图,结构域,嗜中性粒细胞

上海交通大学硕士学位论文亚族中，第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键，第二个与第四形成二硫键。CXC 趋化因子对于嗜中性粒细胞和淋巴细胞具有特征趋化化因子作用于大部分白细胞，但通常对嗜中性粒细胞没有活性。CXC 族可根据是否包含 ELR（glutamate leucine arginine）结构域进一步细分为 ELR 结构域的趋化因子如 CXCL1，CXCL8 和 CXCL7 等与血管生成促，而缺乏 ELR 结构域的细胞因子通常可被 IFN-γ 诱导并产生抑制血管生如 CXCL9，CXCL10 和 CXCL11。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R945

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