【摘要】：目的:微囊藻毒素可引起雄性哺乳动物生殖系统损害,导致小鼠睾丸细胞凋亡。本研究主要探讨MC-LR通过钙离子诱导小鼠雄性生殖细胞凋亡及其分子机制,为制定水环境中MC-LR暴露危害的防治措施和策略提供实验依据。研究方法:第一部分MC-LR暴露诱导小鼠睾丸生殖细胞凋亡选择健康8周龄SPF级雄性ICR小鼠30只。适应性饲养1周后,将小鼠随机分为对照组、10μg/kg MC-LR暴露组和25μg/kg MC-LR暴露组3组,每组10只。采取暴露式气管滴注法进行急性暴露36h。染毒结束后,处死小鼠,收集小鼠睾丸,称重,部分置入10%甲醛中固定,其余放入液氮速冻后保存于-80℃。采用HE染色,观察小鼠睾丸组织病理学改变;采用TUNEL法,检测睾丸组织中生殖细胞凋亡情况;采用免疫蛋白印迹法检测小鼠睾丸组织中细胞凋亡相关蛋白Caspse-3和内质网应激相关的蛋白GRP78,IRE1,CHOP,PERK,Caspase-12表达水平。第二部分钙离子在MC-LR诱发小鼠支持细胞凋亡中的作用研究钙离子在MC-LR诱导小鼠雄性生殖细胞凋亡中的作用,采用胞内钙离子螯合剂Bapta预处理小鼠TM4细胞30min,然后暴露于MC-LR,检测细胞中钙离子浓度、内质网应激反应、线粒体膜电位和细胞凋亡情况。结果:第一部分MC-LR暴露诱导小鼠睾丸生殖细胞凋亡(1)MC-LR暴露诱导小鼠睾丸组织损伤和凋亡发生率明显上升:10μg/kg MC-LR组出现轻微的睾丸萎缩,生精细胞间出现变性、空泡化;25μg/kg MC-LR组睾丸组织生精小管内生精细胞排列紊乱并减少。与对照组比较,MC-LR处理组小鼠睾丸组织阳性小管发生率和单位平均凋亡细胞数均较高,差异具有统计学意义(P0.01)。(2)小鼠睾丸组织凋亡相关蛋白表达的情况:与对照组相比,MC-LR暴露组小鼠睾丸组织中Caspase-3蛋白的表达水平均升高,差异具有统计学意义(P0.05);而Caspase-9蛋白的表达水平均无明显改变。(3)小鼠睾丸组织内质网应激相关蛋白表达的情况:与对照组相比,各剂量MC-LR组小鼠睾丸组织中Caspase-12、CHOP蛋白及25μg/kg MC-LR组小鼠睾丸组织中GRP78蛋白的表达水平均升高,差异有统计学意义(P0.05)。第二部分钙离子在MC-LR诱发小鼠支持细胞凋亡中的作用(1)MC-LR暴露诱导TM4细胞凋亡:与对照组相比MC-LR暴露组促进了TM4细胞凋亡(P0.01),Bapta拮抗了MC-LR的促凋亡作用(P0.05)。(2)MC-LR暴露诱导TM4细胞线粒体膜电位下降:与对照组相比,MC-LR暴露组膜电位下降,差异均具有统计学意义(P0.01);与30μg/mLMC-LR相比,加入Bapta后一定程度上抑制了膜电位的下降,且差异具有统计学意义(P0.05)。(3)MC-LR暴露上调TM4细胞中凋亡相关蛋白表达:与对照组相比,各剂量MC-LR暴露组小鼠睾丸组织中Caspase-3蛋白的表达水平均升高,差异有统计学意义(P0.05)。MC-LR与Bapta的处理后,TM4细胞的MC-LR组Caspase-3蛋白的表达明显低于30μg/mL MC-LR组(P0.05)。(4)MC-LR暴露上调TM4细胞中内质网相关蛋白表达:与对照组相比,各剂量MC-LR暴露组小鼠睾丸组织中Caspase12、Chop和Grp78蛋白的表达水平均升高,差异有统计学意义(P0.01)。MC-LR与Bapta的处理后,TM4细胞的Caspase-12、Chop和GRP78的蛋白表达水平明显低于30μg/mL MC-LR组(P0.05)。(5)MC-LR暴露上调TM4细胞中钙离子调节相关蛋白表达:与对照组相比,各剂量MC-LR暴露组小鼠睾丸组织中p-p38、p-Erk1/2、Erk1/2和p-CaMKⅡ蛋白的表达水平均升高,差异有统计学意义(P0.05)。MC-LR暴露与Bapta的预处理后,TM4细胞的p-p38、p-Erk1/2和p-CaMKⅡ的蛋白表达水平明显低于30μg/mL MC-LR组(P0.01)。(6)MC-LR暴露上调TM4细胞中线粒体相关蛋白表达:与对照组相比,MC-LR暴露组小鼠睾丸组织中Bcl-2、Bax和Cyt c蛋白的表达水平均升高,差异有统计学意义(P0.05)。Bapta预处理后,TM4细胞的Bcl-2、Bax和Cyt c的蛋白表达水平明显低于30μg/mL MC-LR组(P0.05)。结论:(1)MC-LR通过内质网应激诱导小鼠睾丸生殖细胞凋亡。(2)微囊藻毒素MC-LR暴露通过内质网应激和线粒体途径诱导小鼠睾丸支持细胞凋亡中起到重要作用。(3)钙离子在MC-LR暴露诱导小鼠睾丸支持细胞凋亡中起到重要作用。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R99
【参考文献】
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