应用线虫模型研究低分子量蛋白质酪氨酸磷酸酶在应激反应中的作用机制及抗应激天然产物的筛选

发布时间：2020-04-09 03:23

【摘要】：低分子量蛋白质酪氨酸磷酸酶(low molecular weight protein tyrosine phosphatase,LMW-PTP)是一种结构不典型的蛋白质酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases,PTPs),在PTPs家族中被单独分成一类,进化上高度保守,广泛表达于多种生物中,包括植物、原核生物和古细菌等。天然产物在自然界中含量丰富,是重要的药物宝库,在药物开发领域得到了广泛的研究。秀丽线虫(Caenorhabditis elegans,C.elegans)是一种优秀的模式生物,具有繁殖能力强、生命周期短、虫体小易操作、通体透明便于观察、可在液氮中长期冻存、细胞谱系已完全确定等优点。同时,线虫有许多在进化上高度保守的信号通路,与人类基因同源性达60%~80%。线虫lmwptp基因与人类acp1基因同源,经计算机结构模拟得知两者蛋白质三级结构极为相似,因此推测两者生物学功能及作用机制具有相似之处。应激反应是生物体对抗外界刺激所发生反应的总称,随着自然环境的恶化及生活节奏的加快,人们受到体内外刺激的种类和频率逐渐增多,这些刺激会破坏机体氧化和抗氧化系统之间的平衡,影响生物体的日常行为和健康,导致多种疾病的发生,因此生物抗应激的预防及治疗日益受到重视。本文应用线虫模型研究了LMW-PTP在应激反应中的作用机制,并对抗应激天然产物进行了筛选。首先,本文成功构建了用于线虫lmwptp RNAi的pPD129.36-lmwptp质粒并诱导表达,通过免疫家兔成功制备出线虫LMW-PTP多克隆抗体,通过qPCR和Western Blot两种方法证明了lmwptp RNAi的有效性。其次,本文检测了lmwptp RNAi对线虫一般生理指标的影响,发现lmwptp RNAi不影响线虫的寿命、产卵数、吞咽频率、体长,但lmwptp RNAi后第7天的线虫出现了一种特殊运动状态,线虫除了在培养基平面上做正弦曲线运动外,还在垂直方向“抬头”和/或“翘尾”;lmwptp RNAi后线虫体内脂肪含量明显增多,这一现象的产生与lmwptp RNAi后降低一些脂肪分解基因如acdh-1、acs-2的表达量和升高一些脂肪合成基因如fat-6、mdt-15、pod-2、elo-5的表达量有关;并且lmwptp RNAi明显提高了线虫的应激抵抗性,包括热应激、紫外辐射应激和氧化应激抵抗性。然后,本文进一步探究了LMW-PTP在热应激反应中的作用机制,发现lmwptp RNAi可降低线虫体内活性氧簇(reactive oxygen specie,ROS)水平,提高线虫体内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,减少线虫体内脂褐素累积量,LMW-PTP负调控线虫应激抵抗性的作用与类胰岛素信号通路有关,LMW-PTP可能作用于DAF-2,进而改变类胰岛素信号通路下游转录因子DAF-16和HSF-1的细胞核转位及两者下游靶基因的表达量。接下来,本文应用线虫模型对50种天然产物的抗紫外辐射功能进行了筛选,由于薄荷水提物抗紫外辐射的作用效果稳定,因此本文进一步探究了薄荷水提物提高线虫紫外辐射抵抗性的原因,发现薄荷水提物可以降低紫外辐射后线虫体内ROS含量和提高SOD活性,并且这种作用与类胰岛素信号通路有关,薄荷水提物可以促进DAF-16细胞核转位并增加其下游靶基因sod-3、hsp-12.6、hsp-16.1、hsp-16.49的表达量。最后,本文探究了薄荷中的水溶性成分香蜂草苷在线虫抵抗紫外辐射应激过程中的作用和机制,发现了0.1 mM香蜂草苷可以延长线虫寿命,提高线虫抵抗紫外辐射应激、35°C热应激、胡桃醌氧化应激的能力,并且可以降低紫外辐射后线虫体内ROS水平并且提高SOD活性,其提高线虫紫外辐射应激抵抗性的作用与类胰岛素信号通路有关,香蜂草苷可能作用于该通路上游的DAF-2来发挥作用,进而促进DAF-16的细胞核转位,增加下游基因sod-3和hsp-16.2的表达量。综上所述,本文应用线虫模型研究了低分子量蛋白质酪氨酸磷酸酶的生物学功能,着重研究了其在应激反应中的作用机制,并对50种天然产物水提物的抗紫外辐射功能进行了筛选,着重研究了薄荷水提物及其水溶性成分香蜂草苷提高线虫紫外辐射抵抗性的作用机制。本文不仅发现了PTPs家族的新功能,还为抗应激药物的设计和开发提供了理论依据,具有一定的市场前景和社会意义。
【图文】：

图 1. 1 LMW-PTP 氨基酸序列比对图（引自参考文献[24]）Figure 1. 1 LMW-PTP amino acid sequence alignment map

3图 1. 2 LMW-PTP 催化机理示意图（引自参考文献[24]）Figure 1. 2 LMW-PTP catalytic mechanism diagram
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965.1

【相似文献】

相关期刊论文 前4条

1 王月明;姜艳艳;刘斌;;薄荷水提物HPLC特征图谱研究[J];北京中医药大学学报;2010年11期

2 吴可克,王舫,刘建峰,王晓华,单新强;乌发组方要素对酪氨酸酶活性的影响研究[J];日用化学工业;2001年03期

3 方慧;吕圭源;陈素红;苏洁;牟秀华;黄敏聪;;三味辛凉归肺经中药对肺阴虚模型小鼠的影响[J];亚太传统医药;2011年05期

4 孙婧,王建新;白发成因及其防治研究进展[J];香料香精化妆品;2003年06期

相关博士学位论文 前1条

1 周琳;应用线虫模型研究低分子量蛋白质酪氨酸磷酸酶在应激反应中的作用机制及抗应激天然产物的筛选[D];吉林大学;2019年

相关硕士学位论文 前1条

1 孙婧;天然中草药中乌发成分的提取和性能测定[D];江南大学;2005年

，

本文编号：2620221