在中国心脏移植患者中基因多态性对他克莫司体内药物浓度的影响研究
发布时间：2020-04-09 03:38
【摘要】：一研究背景他克莫司(tacrolimus,FK506)是一种钙调磷酸酶抑制剂(calcineurin inhibitors,CNIs),1989年首次应用于临床。FK506的结构虽然与环孢素A(Cyclosporin A,CsA)大不相同,但其作用的机制基本相似,主要是通过特异性抑制钙调磷酸酶活性,从而阻滞T细胞激活过程,同时还有CsA所不具备的T-细胞依赖性抗体的生成,阻滞细胞因子的转录,呈现双重的免疫抑制作用。其药效强度是CsA的10～100倍,它能有效地预防心脏移植术后排斥反应的发生,并具有较少的不良反应,但其药动学个体差异较大、治疗窗狭窄,而且易受其他合并用药的影响。因此,为了确保合适的暴露量,临床实施治疗药物监测(therapeutic drug monitoring,TDM)是十分必要的。目前FK506的检测方法主要有免疫法和液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)。虽然免疫法已实现商业化的规范操作,操作简单、方便、自动化程度高,然而,其灵敏度低、专属性弱,常因FK506代谢物的交叉反应,导致测定的浓度往往高于实际浓度。相反,HPLC-MS/MS只检测FK506母药的浓度,专属性强、准确度高,能校正免疫法的差异。人体对药物反应的个体差异源于与药物药代动力学和药效学相关的各种功能蛋白的分子变异。有关分子变异的研究,主要集中在基因变异对于上述蛋白的表达和功能的影响。目前国内外有关FK506个体化用药研究主要集中在药物代谢酶(CYIP3A4和CYIP3A5)及转运体(P-gp)的遗传多态性上,但是有关药物代谢酶和转运体的调节因子、药效学途径中靶蛋白的遗传多态性与FK506血药浓度的研究较少,仍无定论。二研究内容及方法本研究包括2部分内容,首先开发建立了测定人全血中FK506浓度的HPLC-MS/MS分析方法,并与临床TDM采用的CMIA方法比较,评价两种方法监测FK506浓度的相关性,以及两种方法在治疗药物监测中的应用,探讨在中国心脏移植患者中基因多态性对术后FK506血药浓度的影响,为实现FK506的个体化用药提供理论依据。第一部分HPLC-MS/MS和CMIA法检测心脏移植患者全血他克莫司浓度的比较研究研究目的比较CMIA法与HPLC-MS/MS法监测FK506浓度的相关性,以及两种方法在治疗药物监测中的应用。研究方法1.研究对象:心脏移植患者术后接受FK506治疗药物监测的全血样本(n=581)。2.建立HPLC-MS/MS法测定全血中FK506的血药浓度,并与CMIA测定的结果进行比较,用Bland-Altman法进行一致性分析,计算95%参考区间(即一致限LoA)作为参考区域,若有至少95%的散点位于该一致限内,可认为两种方法的一致性较好。3.用SPSS version 19.0软件进行配对t检验和Pearson线性回归分析两种方法的测定结果,P0.05表示差异具有统计学意义。研究结果1.开发建立HPLC-MS/MS测定人全血FK506浓度,线性范围2-30 ng/ml,定量下限为2 ng/ml;日内及日间精密度(RSD%)均小于15%。2.按照 Bland-Altman 法计算,95.52%LoA=(0.2,5.6),95.52%的差值都位于一致限内,两种方法测定值一致性良好。回归方程为yHPLC-MS/MS=0.7011xCMIA-0.1668(R2=0.9024),说明两种方法具有良好的相关性,CMIA方法的测定值较HPLC-MS/MS方法的测定值高,差异有统计学意义(P＜0.05)。第二部分 在中国心脏移植患者中基因多态性对他克莫司体内药物浓度的影响研究目的探讨在中国心脏移植患者中基因多态性对FK506体内药物浓度的影响。研究方法1.研究对象:2009-2017年阜外医院心脏移植术后服用FK506的200例患者作为实验组,100例健康人作为对照组。2.心脏移植患者初次给予FK506,服药第2天晨起空腹抽取静脉血2 ml(EDTA抗凝),采用 CMIA 法检测 FK506 的全血浓度(blood trough concentration,C0)。3.基因多态性检测:采用PCR-直接测序法、PCR、HMassArray(?)SNP方法对相关位点进行基因分型。1)PCR-直接测序法:CYP3A5*3(rs776746 AG),NR1I2(rs2276707 C＞T),IL-10(rs1800872 C＞A),TGF-β1(rs1800470 C＞T),TGF-β1(rs1800471 G＞C)2)PCR:ACE rs1799752 ID3)MassArray(?)SNP:CYP3A5(rs28365085,T＞C,rs10264272 GA,rs4130334327131_27132insA),CYP3A4(rs35599367 CT,rs2740574 CT,rs28371759 AG,rs2242480CT,rs33972239 delA,rs4646437 AG,rs138105638 GA),CYP2C8*3(rs11572080 CT),ABCB1(rs1128503 CT,rs2032582 GT/A,rs1045642 CT,rs2229109 CT),SLCO1B1(rs2306283 GA),NR1I2(rs6785049 GA,rs3814055 CT),PPAR-α(rs4253728 GA,rs4823613 AG),POR(rs1057868 CT,rs2868177 AG),COMT(rs165599 GA,rs2239393 AG,rs4646312 TC,rs4680 GA,rs6267 GT,rs737865 AG),IL-2(rs2069762 TG,rs2069763 CA),IL-3(rs181781 GA),IL-4(rs2070874 IC),IL-6(rs1800796 GC,rs1800795 GC),IL-10(rs1800871 GA,rs1800896 AG),IL-18(rs1946518 1G),TNF-α-308(rs1800629 GA),TLR-4(rs1927907 GA),CTLA4(rs4553808 AG),PPP3CA(rs3804358 GC),PPP3CB(rs3763679 TC),PPP3R1(rs1868402 GA),CALM1(rs12885713 CT)4.使用 SPSS(version 19.0,SPSS Inc,Chicago,USA)进行统计学处理;计量资料结果用均值±标准差表示,不同基因组间FK506 C0的比较采用非参数统计方法;多组之间的比较采用Kruskal-Wallis检验,两组之间的比较采用Mann-Whitney检验;最终用多元线性回归方法校正可能与FK506血药浓度有关的因素(年龄、性别、肝功能、肾功能),分析基因多态性与FK506血药浓度的关系。研究结果1.除 COMT rs165599,COMT rs6267 和 PPP3R1 rs1868402(P0.01)外,其它 SNPs均符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡定律。患者组 TGF-β1 rs1800470 C、CYP3A5*3 rs776746G 等位基因频率高于对照组(P=0.03);IL-6 rs1800796C、CYP3A4*1G rs2242480 C等位基因的频率低于对照组(P = 0.03)。2.心脏移植患者初始剂量给药后,对FK506C0有统计学差异的基因位点:1)纯合野生型高于杂合/纯和突变型:CYP3A4*1G、CYP3A4rs339722392)纯合野生型低于杂合/纯和突变型:IL-2 rs2069762 TG 3)纯合野生型/杂合低于纯和突变型:CYP3A5*3、CYP3A4rs4646437AG、4)纯和野生型低于纯和突变型:PPP3R1 rs1868402 GA 3.校正年龄、性别等因素后,多元线性回归结果显示,有2个基因多态性位点综合起来可解释23.1%的FK506血药浓度变异,而这23.1%中,CYP3A5*3解释了 38.7%,IL-2 rs2069762 TG 解释了 15.6%。年龄、性别及 CYP3A4*1G、CYP3A4 rs33972239 delA、CYP3A4 rs4646437AG、PPP3R1 rs1868402 GA 均对 FK506 C0的影响均无统计学意义(P0.05)。4.消除 CYP3A5*3 因素的影响后,CYP3A4a*1G、CYP3A4 rs33972239 delA、CYP3A4 rs4646437 AG、PPP3R1 rs1868402 GA 及 IL-2 rs2069762 TG对FK506C0的影响均无统计学意义(P0.05)。三研究结论1.LC-MS/MS方法定量检测全血中FK506的浓度,具有很好的专属性,不会与FK506体内代谢产物产生交叉反应,使得测量值更准确可信。2.CMIA法和LC-MS/MS法在检测FK506血药浓度时具有良好的一致性和相关性,均可用于常规TDM。3.在中国心脏移植患者中,FK506 C0与CYP3A5*3、IL-2 rs2069762 TG之间存在相关性。4.通过基因分型,结合TDM常规,能客观地预测不同患者移植术后使用FK506的初始剂量,提高免疫治疗效果,降低毒性反应。
【图文】：
５．统计分析逡逑（１）用Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ法进行一致性分析。计算原始数据每一个配对的均值与差逡逑值，绘制Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ散点图。同时计算９５％参考区间（即一致限ＬｏＡ）作逡逑为参考区域，若有至少９５％的散点位于该一致限内，可认为两种方法的一逡逑致性较好。逡逑（２）用ＳＰＳＳ邋ｖｅｒｓｉｏｎ邋１９．０软件进行配对ｔ检验和Ｐｅａｒｓｏｎ线性回归分析两种方法逡逑的测定结果，Ｐ＜０．０５表示差异具有统计学意义。逡逑研究结果逡逑１．邋ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法学考察与评价逡逑１．１专属性逡逑在本实验条件下，ＦＫ５０６和内标ＦＫ－５０６－１３Ｃ，Ｄ２（Ｍａｊｏｒ）的保留时间分别为逡逑１．７５ｍｉｎ、１．７４ｍｉｎ，空白全血中内源性物质不干扰ＦＫ５０６及内标的测定，见图１。逡逑Ａ逡逑
３．邋ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法与ＣＭＩＡ法结果比较逡逑按照Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ法计算，９５．５２％的差值都位于一致限ＬｏＡ邋（０．２，５．６）内，逡逑可认为两种方法的一致性较好，见图２。逡逑１０邋－逡逑？逦Ｏ逡逑0逡逑８邋－邋0邋0逡逑0邋０逡逑６逦逦逦邋l捨海卞逦瘛╁邋五五五义希ⅲ村澹，
本文编号：2620239
【图文】：
５．统计分析逡逑（１）用Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ法进行一致性分析。计算原始数据每一个配对的均值与差逡逑值，绘制Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ散点图。同时计算９５％参考区间（即一致限ＬｏＡ）作逡逑为参考区域，若有至少９５％的散点位于该一致限内，可认为两种方法的一逡逑致性较好。逡逑（２）用ＳＰＳＳ邋ｖｅｒｓｉｏｎ邋１９．０软件进行配对ｔ检验和Ｐｅａｒｓｏｎ线性回归分析两种方法逡逑的测定结果，Ｐ＜０．０５表示差异具有统计学意义。逡逑研究结果逡逑１．邋ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法学考察与评价逡逑１．１专属性逡逑在本实验条件下，ＦＫ５０６和内标ＦＫ－５０６－１３Ｃ，Ｄ２（Ｍａｊｏｒ）的保留时间分别为逡逑１．７５ｍｉｎ、１．７４ｍｉｎ，空白全血中内源性物质不干扰ＦＫ５０６及内标的测定，见图１。逡逑Ａ逡逑
３．邋ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法与ＣＭＩＡ法结果比较逡逑按照Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ法计算，９５．５２％的差值都位于一致限ＬｏＡ邋（０．２，５．６）内，逡逑可认为两种方法的一致性较好，见图２。逡逑１０邋－逡逑？逦Ｏ逡逑0逡逑８邋－邋0邋0逡逑0邋０逡逑６逦逦逦邋l捨海卞逦瘛╁邋五五五义希ⅲ村澹，
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