靶向抑制血小板纳米载体的构建及其抗肿瘤机制的研究

发布时间：2020-04-09 15:26

【摘要】：恶性肿瘤是威胁人类健康的头号杀手,而肿瘤转移是导致癌症病人死亡的直接原因。癌症治疗面临着两大挑战,一是肿瘤细胞的转移,二是化疗药物在肿瘤部位的富集。临床上治疗肿瘤的手段主要以手术,放化疗为主,而多数病人在发现癌症时已经处于晚期,可以手术的机率很低。常用的化疗手段由于其特异性低,肿瘤部位药物的富集量少,会导致严重的毒副作用。纳米医学作为一门新兴学科,给癌症治疗带来了新的希望。通过精准的纳米药物设计,在延长药物血液半衰期的同时,实现化疗药物的定点可控释放。通过高渗透长滞留(EPR)效应增强药物在肿瘤部位的富集,降低药物的全身毒副作用。临床上已经有多种纳米药物被批准,如:Genexol?-PM,Abraxane?,Transdrug?,Doxil/Caelix?Dauno Xome?,Myocet?等,也有许多处于不同阶段的临床试验中。但是,临床试验中,研究者没有发现纳米药物的明显EPR效应,也就是说,EPR效应只在动物模型上明显。因此,寻求新的增强药物在肿瘤部位的富集方法显得尤为重要。血小板是由骨髓巨核细胞脱落形成的无核细胞碎片,其主要生理功能是凝血和止血。而近期大量的临床观察及临床前实验都表明,血小板对肿瘤的发生发展及转移具有重要的作用:1.可以通过分泌多种细胞因子,来促进肿瘤细胞增殖或者肿瘤血管新生;2.通过分泌TGF?促进肿瘤细胞发生内皮间叶转化,促使肿瘤细胞获得侵袭表型,更容易发生转移;3.在血液循环中,通过粘附肿瘤细胞,保护肿瘤逃避免疫细胞的攻击及高速的血流冲击;4.通过分泌趋化因子,诱导肿瘤细胞向靶器官的侵袭定位;5.通过分泌炎症保护因子或者物理封闭作用,维持肿瘤血管完整性,保证肿瘤组织具有足够的养分供给。综上所述血小板对肿瘤进展的贡献,抑制肿瘤相关血小板成为靶向治疗肿瘤的新策略。大量的临床证据表明,阿司匹林的长期使用,可以大大降低癌症的发病风险。也有许多临床前实验结果表明,血小板抑制剂的使用,可以显著降低肿瘤细胞的增殖和转移。但血小板抑制剂的大量全身应用,存在着一定的出血风险,这就限制了血小板抑制剂的临床使用。基于以上肿瘤治疗面临的障碍,开发新的治疗策略显得尤为重要。但是无论是预防肿瘤转移还是增加药物在肿瘤组织的富集,新的治疗策略必须保证安全性问题。我们首先设计了可以靶向肿瘤微环境的载带血小板抑制剂的脂质体纳米颗粒CREKA-Lipo-T。CREKA-Lipo-T通过靶向肿瘤血管内皮表面的纤连蛋白复合物,在肿瘤微环境中缓慢释放血小板抑制剂替卡格雷,从而抑制血小板的功能,最后达到抑制肿瘤细胞转移的目的。我们通过薄膜水化分散法制备载药脂质体纳米颗粒。在体外细胞实验中,我们研究了血小板诱导肿瘤细胞发生内皮间叶转化的过程,而CREKA-Lipo-T可以通过抑制血小板的功能,从而抑制肿瘤细胞发生内皮间叶转化。我们也对CREKA-Lipo-T抑制肿瘤细胞侵袭的能力进行了研究,发现血小板可以促进肿瘤细胞侵袭,而CREKA-Lipo-T可以显著抑制这种作用。体内抗转移实验结果表明,CREKA-Lipo-T可以显著抑制4T1肿瘤模型的肺转移,且没有引起可见的肺部出血并发症。而游离药物组虽然也可以抑制肿瘤细胞的肺转移,但是带来了一定的肺部出血风险。总结本课题,我们通过微环境靶向纳米颗粒将血小板抑制剂定点输运到肿瘤局部,实现抑制血小板功能进而抑制肿瘤细胞转移的目的。基于血小板在维持肿瘤血管完整性的生理功能,我们接下来设计了一个同时载带化疗药物阿霉素(Dox)和血小板敲除抗体R300的磷脂聚合物杂化纳米载体,并且在外层磷脂层设计了肿瘤部位高表达的基质金属蛋白酶2(MMP2)响应的功能。当纳米颗粒进入肿瘤组织局部时,外层磷脂层被MMP2酶切,释放血小板敲除抗体R300,敲除肿瘤局部维持血管完整性的血小板,从而实现增大肿瘤血管内皮间隙的目的。同时释放出带正电荷的载药内核,可以高效的透过血管内皮间隙,杀伤肿瘤细胞。我们首先通过两步乳化法合成了载有疏水阿霉素的聚合物内核,并对其载药率进行测定和优化。然后通过薄膜水化分散法合成掺杂有MMP2酶响应性多肽的磷脂双分子薄膜,并将其包裹到聚合物内核上,合成环境响应性磷脂聚合物杂化纳米颗粒PLP-D-R。体外的酶响应实验证明,在MMP2酶的作用下,PLP-D-R可以有效释放血小板敲除抗体及阿霉素,且释放的抗体保持了高效促血小板聚集的功能。细胞活力实验同样也表明,PLP-D-R的细胞毒性具有MMP2酶依赖性,当加入MMP2酶抑制剂后,对肿瘤细胞的杀伤作用明显降低。体内药物代谢和分布实验表明,阿霉素和血小板敲除抗体的纳米化可以显著延长其半衰期。而无论是和没有酶响应功能的纳米载体LP-D-R比,还是和没有抗体R300的PLP-D比,PLP-D-R在肿瘤部位的富集量都大大提高。血小板的免疫组化结果表明,PLP-D-R可以敲除肿瘤局部的血小板,且对血液循环中的血小板数量影响不大。通过免疫组化,扫描电镜,高分辨率透射电镜实验探讨PLP-D-R增加纳米颗粒瘤内富集的机制,发现给药后肿瘤血管内皮之间的间隙增大,且有红细胞渗透的现象,据此分析,血小板是通过维持血管内皮之间的间隙发挥作用的。两种肿瘤模型的体内抗肿瘤实验结果表明,PLP-D-R对肿瘤部位的MMP2的表达具有一定的依赖性,但两者中都可以明显提高纳米药物的抗肿瘤效果,同时又没有发现明显的出血并发症。总结本课题,我们通过微环境响应的磷脂聚合物杂化纳米载体,实现了血小板抗体的安全高效运输,使其在肿瘤微环境中发挥作用,增加纳米药物在肿瘤部位的富集,为临床应用中纳米药物渗透滞留(EPR)效应效率低的问题,提供了新的解决思路。
【图文】：

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肿瘤微环境肿瘤微环境是肿瘤发生和生长的内在环境，主要由多种基质细胞（肿瘤维细胞，肿瘤相关巨噬细胞，肿瘤相关血小板，中性粒细胞及各种免疫胞外基质（胶原蛋白，层粘连蛋白，金属基质蛋白酶，整合素家族等）[1-2]。通过与肿瘤细胞相互作用，对肿瘤细胞的发生发展以及转移发挥的作用（图 1.1）[3-6]。一百多年前，Paget 提出肿瘤的种子和土壤‖学说为：肿瘤细胞是种子‖，要想能够快速生长或发生远端转移，需要有合微环境或前转移微环境。也就是说，肿瘤细胞要想生存或者转移，离不环境中各种成分的协同作用。近几年来，针对肿瘤微环境的各种治疗手穷[9-10]，究其原因，主要是由于肿瘤细胞的异质性，导致以肿瘤细胞为疗策略遇到了很大的瓶颈，尤其是容易产生耐药[11-15]。而近年来以肿瘤成分为靶点的治疗策略响应性好，不容易产生耐药，备受研究者的青睐

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介入治疗，免疫治疗，细胞治疗等，但不同类型肿瘤的临床表现这些手段的敏感性也不一样，同时化疗药物会给患者带来巨大的毒肿瘤治疗带来困难[22-25]。纳米医学的出现，给肿瘤治疗带来了新已经有多种纳米药物获批并取得了比传统化疗药物更好的治疗效更低[26-28]。纳米药物主要是通过被动靶向（The enhanced permeabon: EPR 效应）和主动靶向来实现在肿瘤部位的高效富集的（图 1.2位的血管发育不完全，，血管内皮细胞之间存在许多间隙，这就使得过肿瘤部位的时候，更容易被肿瘤组织所截留。而纳米药物的尺寸样它就无法穿透正常的血管内皮进入机体其他器官，大大降低了毒瘤靶向策略被称作被动靶向‖[33-35]。通过在纳米药物表面修饰肿瘤实现的靶向被称作主动靶向‖，已经有相当多的临床前研究表明，好的发挥抗肿瘤效果，且毒副作用进一步被降低[36-37]。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943

【参考文献】