阿托伐他汀对人肺癌HCC827细胞增殖、凋亡和迁移的作用及机制研究

发布时间：2020-04-11 10:05

【摘要】：肺癌在男性和女性癌症患者中均居首位,严重威胁着人类的健康。目前,对于肺癌的治疗主要采用手术和化学治疗为主,但治疗效果并不理想,其中,有相当比例的患者产生耐药。寻找新的药物作用靶点对于降低肺癌死亡率有重要意义。他汀类药物是羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,在临床上广泛用于高脂血症的预防和治疗。近年,流行病学研究资料表明长期使用他汀类药物可以有效降低结肠癌、直肠癌、前列腺癌等癌症发病率。但其对肺癌的作用尚不清楚,本课题中,我们研究了阿托伐他汀对人肺癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响并进一步探究了其相关作用机制。肿瘤转移是导致恶性肿瘤患者死亡的主要原因。上皮间充质转化(EMT)是发生肿瘤转移的重要机制,它是由复杂的多基因调控完成的。EMT的发生参与了细胞的迁移过程。TGF-β1是发生EMT的关键因子。本实验中,我们通过划痕实验和Transwell体外侵袭实验观察阿托伐他汀对HCC827细胞迁移能力的变化,并建立以TGF-β1诱导的HCC827细胞体外EMT模型,进一步检测阿托伐他汀对TGF-β1诱导的HCC827细胞迁移的影响,同时检测了阿托伐他汀对EMT过程中的标志性蛋白E-cadherin、N-cadherin以及迁移相关蛋白MMP2表达的作用。第一部分阿托伐他汀对人肺癌HCC827细胞增殖和凋亡的作用目的:研究阿托伐他汀(atorvastatin,ATO)对人肺癌细胞株HCC827增殖和凋亡的影响并探究其作用机制。方法:台盼蓝染色计数法检测阿托伐他汀对人肺癌HCC827和A549细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测HCC827细胞周期的变化;光学显微镜下观察细胞形态的变化;Hoechst 33342和TUNEL法检测细胞凋亡;DCFH-DA(2,7-dichlorofluorescenin diacetate)荧光探针检测活性氧(ROS)水平;比色法检测丙二醛(MDA)含量变化;Western blot法检测P-H2A.X、Cleaved-caspase 3、Bax和Bcl-2蛋白表达。结果:1.阿托伐他汀药物浓度在0-40μM时,随着给药浓度的增加,对人肺癌HCC827细胞和A549细胞增殖的抑制作用越明显,细胞的存活率不断降低,且阿托伐他汀对HCC827细胞的抑制作用明显强于A549细胞,抑制作用呈剂量和时间依赖性。2.流式细胞术检测结果显示,不同浓度阿托伐他汀(2.5μM、10μM、40μM)作用后,与对照组相比,阿托伐他汀组处于G1期细胞的数量明显增多,处于S期和G2期细胞比例都降低。3.光学显微镜下观察细胞形态,对照组细胞生长状态良好,阿托伐他汀组细胞皱缩、体积变小、脱落、漂浮于培养液中的死细胞明显增多。4.Hoechst 33342染色结果显示,阿托伐他汀作用后,改变了HCC827细胞核的形态,细胞核呈现染色质浓缩、呈新月状等凋亡特征。5.TUNEL荧光染色结果显示,阿托伐他汀组细胞核内绿色荧光强度明显高于对照组,提示阿托伐他汀诱导HCC827细胞DNA断裂。6.DCFH-DA荧光探针检测HCC827细胞活性氧(ROS)水平结果显示,与对照组相比,阿托伐他汀组细胞绿色荧光显著增强,说明胞内ROS水平显著增加。7.比色法检测丙二醛(MDA)含量结果显示,阿托伐他汀组HCC827细胞内MDA含量随着阿托伐他汀药物浓度的增加不断提高。8.阿托伐他汀可上调HCC827细胞中P-H2A.X、Cleaved-caspase 3和Bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,Bax/Bcl-2比值上调。小结:阿托伐他汀能明显抑制HCC827和A549细胞的生长,且对HCC827细胞生长抑制作用更明显,生长抑制作用可能与其引起细胞周期阻滞有关;阿托伐他汀可诱导HCC827细胞产生凋亡,这可能与氧化应激和凋亡相关因子的调控参与了阿托伐他汀诱导HCC827细胞的凋亡有关。第二部分阿托伐他汀对人肺癌HCC827细胞迁移的作用目的:研究阿托伐他汀对人肺癌HCC827细胞迁移的影响并探究其作用机制。方法:采用划痕实验和Transwell体外侵袭实验检测阿托伐他汀对HCC827细胞迁移的影响;Western blot法检测细胞内E-cadherin、N-cadherin和MMP2蛋白的表达。结果:1.细胞划痕实验结果显示,阿托伐他汀能够明显抑制HCC827细胞的迁移,TGF-β1能够明显促进HCC827细胞的迁移,阿托伐他汀还能够明显抑制TGF-β1诱导的HCC827细胞的迁移。2.Transwell体外迁移实验结果显示,阿托伐他汀可明显降低HCC827细胞的穿膜细胞数,TGF-β1明显增加了HCC827细胞的穿膜细胞数,与TGF-β1组相比,阿托伐他汀联合TGF-β1组穿膜细胞数明显降低。3.阿托伐他汀降低了HCC827细胞N-cadherin和MMP-2蛋白的表达,对E-cadherin蛋白的表达无影响;TGF-β1能够明显增加HCC827细胞N-cadherin、MMP-2蛋白的表达,对E-cadherin蛋白的表达无影响;阿托伐他汀能够明显降低TGF-β1诱导的HCC827细胞N-cadherin和MMP-2蛋白的高表达,对E-cadherin蛋白的表达无影响。小结:阿托伐他汀能够抑制HCC827细胞的迁移,也能够抑制TGF-β1诱导的HCC827细胞的迁移,可能与阿托伐他汀干扰HCC827细胞EMT过程以及下调MMP2蛋白表达有关。结论:1.阿托伐他汀能够抑制HCC827细胞的增殖,该增殖抑制作用可能与阿托伐他汀干扰HCC827细胞周期有关;阿托伐他汀可诱导HCC827细胞产生凋亡,这可能与氧化应激介导途径和凋亡相关因子的调控参与了阿托伐他汀诱导HCC827细胞的凋亡。2.TGF-β1可以诱导HCC827细胞EMT的发生,阿托伐他汀能够抑制HCC827细胞的迁移,也能够抑制TGF-β1诱导的HCC827细胞的迁移,可能与阿托伐他汀干扰了HCC827细胞EMT过程以及下调MMP2蛋白表达有关。
【图文】：

阿托伐他汀,细胞周期

图 1 阿托伐他汀对 HCC827 和 A549 细胞增殖的影响Fig.1 Effect of atorvastatin on proliferation of HCC827 and A549 cells. (A)Survival rate of HCC827 cells after 24 h, 48 h and 72 h treatment withatorvastatin at different concentration gradients (2.5 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM,40 μM). (B) Survival rate of A549 cells after 24 h, 48 h and 72 h treatmentwith atorvastatin at different concentration gradients (2.5 μM, 5 μM, 10 μM,20 μM, 40 μM). The experimental results are expressed as mean ± standarderror (n = 3,*P < 0.05 compared to the control group, **P < 0.01 compared tothe control group).2. 阿托伐他汀对HCC827 细胞周期的影响经流式细胞术检测阿托伐他汀对HCC827 细胞周期的结果显示，空白对照组与不同浓度梯度的阿托伐他汀（2.5 μM、10 μM、40 μM）作用于HCC827 细胞 48 h后处于G1 期的细胞数所占的比例分别为 47.3 ± 9.9 %，

阿托伐他汀,细胞周期,细胞

图 2 阿托伐他汀对 HCC827 细胞周期的影响ffect of atorvastatin on HCC827 cell cycle. Atorvastatin withration gradients(0 μM, 2.5 μM, 10 μM, 40 μM) induced G17 cell cycle after 48 h treatment. The experimental reed as mean ± standard error (n = 3, *P < 0.05 compared to th*P < 0.01 compared to the control group).阿托伐他汀对HCC827 细胞形态的影响显微镜下可以明显地看出，对照组细胞生长状态良好、贴中未见大量漂浮细胞。不同浓度梯度的阿托伐他汀（2.5 μM）作用于HCC827 细胞 48 h后，可见给药组细胞随着浓明显地形态变化：细胞皱缩、体积变小、脱落死亡，培养液亡细胞。（Fig.3）。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

【参考文献】