三维人鼠杂交A_L遗传毒性检测体系构建及其毒理学研究
发布时间：2020-04-11 16:00
【摘要】：现阶段,社会经济的高速发展,外源性有害物质急需进行风险评估,毒性风险评估依靠大量的动物实验,而动物实验存在周期长、成本高以及伦理道德等问题,毒理学替代研究逐渐受到重视。研究人员经过不断实验改进,采用体外细胞实验等技术代替动物毒性检测实验,逐步形成了替代毒理学这一具有鲜明特色的学科,但是在替代毒性检测实验中,遗传毒性检测的有效替代模型还处于起步发展阶段,许多细节尚不清楚。CD59突变检测体系能够有效评估环境因素中诱变剂引发的遗传毒性,因此我们利用琼脂糖低黏附培养技术构建该体系的三维细胞模型,评价该体系在形态学、生化指标方面的信息,对比三维体系与传统单层细胞的环境毒理响应差异。主要研究结果如下:1.形态学观察。通过对不同条件下细胞形态的动态观察,发现二维细胞呈现出单层贴壁生长形态,细胞团呈现出近似于球状生长形态,培养期间细胞团形态不均一,筛选后分析各类细胞团特征发现致密细胞团特性较为稳定,因此我们最终选择琼脂糖低黏附悬浮培养法建立三维体系模型。深入观察致密细胞团发现,随着培养时间的增加,细胞团逐渐增多,形态会更加均匀,连续培养8天后,细胞团直径达240 μm,单细胞团内约有1725个细胞。研究结果说明细胞生长微环境的改变会导致细胞间连接的重新排列,从而使得细胞形态发生变化,最终影响到细胞的结构和功能。2.自发突变率及生化指标检测。为鉴定该细胞团是优良的三维培养体系,我们通过克隆形成法和CD59基因突变检测分析三维培养体系中细胞活性和本底突变情况,研究发现三维体系在连续培养期间保持良好的细胞增殖能力,突变本底没有显著变化。另一方面,通过实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分析了细胞特异性基因表达产物,研究发现三维体系中细胞干性相关基因(Oct4、Nanog、Sox2、Lin28等)以及细胞连接基因(Connexin 43和LI-Cadherin)有明显上调现象,其中培养8天的三维体系中Oct4基因表达倍数为5.90 ± 0.53,Cx43基因表达倍数为3.20 ± 0.20,研究结果均表明三维体系表现出比二维细胞更好的增殖能力和细胞连接能力。3.环境物质毒性评估。构建稳定三维培养模型后,我们首先评价环境污染物毒性效应,包括重金属、持久性有毒污染物以及纳米材料,实验结果表明三维体系存活率更高、突变率更低,表现出明显的抵抗作用,元素摄取实验发现三维体系多层结构能抵挡外源性污染物进入内部细胞,同时鉴于射线能够穿透细胞层,我们进一步研究辐射损伤效应,结果表明修复蛋白高表达以及细胞周期停滞等原因,三维体系具有明显的辐射抵抗效应。研究结果表明三维培养体系由于多层结构与动物组织结构一致,生化特性与体内细胞相类似,因此能够提供更为准确的体内细胞信息。综上所述,我们采用琼脂糖低黏附悬浮培养法构建三维遗传毒性检测体系,通过动态观察、稳定性评估、毒性检测等结果说明三维培养体系作为遗传毒性检测的有效替代模型,能够为毒理学研究提供更接近于体内细胞的信息。
【图文】：
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ｍｅｔａｎｅｐｈｒｉｃ邋ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ逡逑胚胎干细胞类器官逡逑图１．４细胞组织培养发展史\″义希疲椋纾酰颍邋澹保矗澹龋椋螅簦铮颍澹铮驽澹悖澹欤欤酰欤幔蝈澹簦椋螅螅酰邋澹悖酰欤簦酰颍邋义希保卞义
本文编号：2623770
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