RGD-transTat抑制新生血管生成活性的初步研究

发布时间：2020-04-12 03:26

【摘要】：与血管生成相关的疾病如实体肿瘤、眼部血管增生类疾病是研究工作中一类热点疾病,抑制新生血管的生成是治疗此类疾病的首要选择。病理性新生血管的生成多与促血管生成因子和血管生成抑制因子的失衡有关。其中,促血管生成因子主要包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)等,对新生血管的生成起着至关重要的的作用。Tat作为细胞穿膜肽已得到广泛应用,在Tat的帮助下蛋白质、核酸、脂质体等都能顺利穿透细胞膜,进入细胞。RGD可以与整合素αvβ3特异性结合,通常作为靶向肽应用于各类研究。碳端规则(C-end rule,CendR)是Ruoslahti团队利用噬菌体展示技术发现的一种位置效应。在碳端具有R/KXXR/K结构的肽链可以与靶细胞上的神经纤毛蛋白1(NRP1)受体结合,其中X表示除精氨酸与赖氨酸之外的任意氨基酸,R/KXXR/K结构需位于肽链碳端。Tat序列中存在RKKR元件,但其位于肽链的氮端而非碳端,逆序后的Tat即transTat严格符合CendR。因此,本课题以transTat作为研究对象,考察其穿膜性与抑制新生血管生成的活性。为使transTat具有更好的靶向作用,将RGD与transTat连接,考察RGD-transTat抑制新生血管生成活性,为治疗新生血管疾病的肽链提供多一种选择。本文的主要研究内容与结果如下:(1)TransTat和Tat穿膜性的对比研究本研究中首先对比研究了 transTat和Tat穿膜活性。通过细胞摄取实验与荧光倒置显微镜观察结合发现transTat的穿膜能力与Tat相当,将Tat序列逆转后得到的transTat对tat的穿膜能力没有影响。(2)TransTat、RGD-transTat抑制新生血管生成活性的初步研究通过细胞增殖实验、划痕实验、成管实验以及鸡胚尿囊膜模型评价了 Tat、transTat、RGD、RGDtransTat和transTatRGD 5种多肽抑制新生血管的生成活性。结果表明,Tat与transTat对于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞增殖与成管没有显著性影响,对HUVEC的迁移有一定的抑制作用,但二者之间没有显著性差异,可以表明逆序后的Tat,即transTat,没有显示出更强的抑制新生血管生成的活性。RGD-transTat对HUVEC细胞增殖、迁移以及成管的抑制作用明显增强,且RGD位于肽链碳端与氮端对transTat活性没有显著影响。(3)Tat、transTat、RGD、RGDtransTat 和 transTatRGD 与 NRP1、整合素αvβ3的结合能力利用HUVEC细胞摄取实验以及通过共聚焦显微镜观察Tat、transTat、RGD、RGDtransTat 和 transTatRGD 5 种多肽在 HUVEC 细胞上与 NRP-1、整合素αvβ3的共定位,结合实验结果可以发现,除RGD外,Tat、transTat、RGDtransTat和transTatRGD 4种多肽对NRP1均具有一定的结合能力,transTatRGD稍弱一些。Tat与transTat对αvβ 3的特异性结合与RGDtransTat、transTatRGD相比较弱。本论文的创新点包括:(1)将Tat逆序后得到一种新的穿膜肽transTat,并对其抑制新生血管生成的活性进行了初步评价。(2)将 RGD 与 transTat 连接合成 RGDtransTat 和 transTatRGD,研究了它们抑制新生血管生成的活性以及初步的作用机制,并评价了 RGD位于碳端与氮端对transTat活性的影响。
【图文】：

逡逑图２－３邋ｔｒａｎｓＴａｔ对Ｔａｔ的穿膜能力的影响（见实验记录本０００５３５８－ｐ６８－ｐ７0）逡逑（蓝色表示细胞核位置、绿色表示药物位置）逡逑Ｆｉｇ．Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓＴａｔ邋ｏｎ邋Ｔａｔ＊ｓ邋ａｂｉｌｉｔｙ邋ｔｏ邋ｐｅｎｅｔｒａｔｅ邋ｔｈｒｏｕｇｈ邋ｔｈｅ邋ｍｅｍｂｒａｎｅ逡逑（Ｂｌｕｅ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｔｈｅ邋ｎｕｃｌｅｕｓ邋ａｎｄ邋ｇｒｅｅｎ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｔｈｅ邋ｄｒｕｇ）逡逑３．３邋ＨＵＶＥＣ邋对邋ＴｒａｎｓＴａｔ、Ｔａｔ邋的摄取率逡逑通过流式细胞术检测ＨＵＶＥＣ对ＴｒａｎｓＴａｔ、Ｔａｔ的摄取率，结果如图２－４所示。逡逑结果显示，０．５邋ｈ时，ＨＵＶＥＣ对二者的摄取率已经达到９７％左右，ｔｒａｎｓＴａｔ的摄逡逑取率略高一些，二者具有显著性差异；ｌｈ时，二者的摄取率均达到９９％以上，逡逑没有显著性差异。结果表明，ｔｒａｎｓＴａｔ可能穿透细胞膜的速度更快，，但是总体来逡逑说两者的穿膜能力没有差别。逡逑逦Ｔ说逦邋ｔｒａｉ＾Ｊａｔ逦逡逑０．５邋ｈ逦§逡逑Ｓ：逦．逡逑１＾－逦灥逦ｖ逦煖逡逑°逦■逦°邋ｓ－逡逑８」逡逑－—ｍｉｉ＞｜邋ｉ邋ｍｍ邋－邋ｉ逦ｉ邋ｉ邋ｍｉ邋ｉ邋ｍｍ逡逑？０＊邋Ｉ０４邋ＪＯ＇邋Ｉｌｆ邋１邋｝0？邋ｔｏ＊邋＞０＊邋）0？邋＞ｌｆ邋ｔｏ７逡逑ＦＩＴＣ－Ａ逦ｒｉＴＣ－Ａ逡逑ｆｌ逦１１逦ＰＩ逡逑１邋Ｈ邋ｇ邋１逡逑；逦ｆｌ：逡逑ｎ逦ｆｔ逦Ｈ：逦Ｂ逡逑３邋；逦

本文编号：2624218