重组人血清白蛋白及其残留HCP的免疫原性和水稻人源化糖苷修饰研究

发布时间：2020-04-12 05:01

【摘要】：水稻是高度自花授粉的作物,由于它不含有任何有害成分,因此是美国联邦食品药品管理局(FDA)公认的安全(General recognized as safe,GRAS)植物。已经证明水稻胚乳作为生物反应器生产医用蛋白闩具有成本低、提取纯化工艺简单、规模化容易、安全性好等优势,因此它可以成为重组蛋白质药物的最好平台之一。虽然植物技术平台相对于微生物和动物细胞技术平台具有较多的优势,但利用植物生物反应器生产医药产品(plant-made pharmaceutical,PMP)的植物源生物药物的安全性较为关注。通常,影响生物药物的安全性主要来源于与宿主相关、药物相关和加工相关杂质,由于植物细胞的重组蛋白的糖苷修饰与人类具有相似的糖骨架,但在岩藻糖和木糖的修饰存在差异,因此植物糖修饰的免疫原性成为与药物相关的杂质,是水稻胚乳细胞生产生物医药的关键因子之一。现有研究结果表明水稻胚乳表达OsrHSA具有高效、稳定和经济有效,水稻种子中蛋白N-糖基化模式较为简单。由于不同的蛋白质表达系统具有糖苷修饰差异,植物中生产的生物药物的糖基化将植物特异性N-聚糖残基,αa-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖添加到最终的糖基化产物中。这些植物特异性N-聚糖的存在可以显著改变生物药物的稳定性和活性,一些研究已经证明,通过基因工程在植物中通过人源糖基化类型生产药物可以改变植物细胞的N-糖基化结构。人血浆主要由人血清白蛋白的蛋白质组成,它是一种单体非糖基化蛋白质。它常以高剂量用于治疗各种疾病和伤害,如手术失血,血容量不足,严重烧伤等引起的贫血。作为血浆来源的HSA替代物,重组人血清白蛋白是一种安全性高并且供应来源广泛的生物制药。中国已经在转基因水稻胚乳中大规模生产了的植物源重组人血清白蛋白(human serum albumin from Oryza Sativa,OsrHSA)OsrHSA,并且最近中国食品药品监督管理局批准它在中国进行临床试验,OsrHSA的HCPs安全性则是其中的一个关键问题。研究结果表明:OsrHSA与血浆来源人血白蛋白(Plasma HSA)在理化和物理性质上完全相同或相似。因此,OsrHSA的安全性问题不是来自HSA木身,而是来自OsrHSA加工过程中产生的杂质,尤其是残留宿主细胞蛋白(Host Cell Proteins,HCPs)。但是HCP不可能在下游加工过程中彻底去除。虽然OsrHSA中的残留HCP控制在低至1.5|μg/g的浓度,但由于HSA在临床应用中临床剂量超过50克以上,总HCP含量仍然很高。通常,生物药的安全性不仅受HCP水平,还受其种类的影响。虽然许多复杂方法已被用于去除和降低HCPs含量,但由于不能完全排除这些杂质,残留HCPs作为关键质量属性(Critical Quality Attributes,CQA)之一。而HCPs潜在的免疫原性是在OsrHSA临床应用中最关注的风险。因此,将OsrHSA中残留的HCPs作为CQA的表征以及通过不同方法评估免疫原性非常重要。目前为止,关于OsrHSA中HCPs的免疫原性尚没有报道,对残留HCPs的免疫原性在临床前或临床试验的相关研究也未见报道。因此,利用动物系统的临床前试验研究获得OsrHSA中的HCP的免疫原性和免疫毒性的直接证据显得至关重要。在本研究中,针对水稻胚乳细胞生物反应器的蛋白药物中与宿主相关的主要成分之一 HCPs安全性和与药物相关的植物类型N-糖苷的人源化进行了研究。首先,我们使用Sprague-Dawley大鼠评估了 OsrHSA及其残留HCPs的免疫原性和细胞毒性进行系统评价,对包括对动物主动脉血样进行血液学和生化分析、细胞因子、C-反应蛋白(CRP)和血浆循环免疫复合物、补体和抗药物抗体(ADA)的等关键性安全指标进行了分析。然后采用TALENs基因组编辑技术,对水稻胚乳细胞的人源化糖苷修饰进行遗传改造,以期获得具有人源岩藻糖结构和半乳糖、唾液酸结构的糖苷结构。在水稻基因组内分别敲除α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase,OsFUT)或β-1,2-木糖基转移酶(β-1,2-xylosyltransferase,OsXylT)基因,同时将人的岩藻糖基转移酶(FUT8)和人的半乳糖苷转移酶基因(GalT)导入水稻基因组。主要结果如下:HCP组或阴性对照组中均未观察到动物死亡或异常反应。所有处理组的体重均有增加,但在D42与对照组未见明显的体重增加。实验发现,雄性动物体重的上升趋势远高于雌性动物,而HCP组的体重与阴性对照组相比较并没有显著变化。在HCP和阴性对照血液学和凝血相关参数也没有显著差异。结果表明:与阴性对照相比,OsrHSA的残留HCP不会引起任何血液生化的改变。对HCP的免疫毒性评估结果,通过监测CD4+和CD8 + T细胞,结果发现,在给药后的D15,HCP组与阴性对照组相比时,CD8 + T细胞没有显着差异。然而,给药后的D15,CD4 + T细胞和CD4 +/CD8 + T细胞比例在HCP组中与阴性对照组之间存在显著差异。尽管在D15的CD4 +/CD8+比例有实质性差异,但淋巴细胞百分比仍处于临床正常范围,这些变化并未显示药物剂量与给药时间之间的相关性。因此,我们并不认为这些变化与这种药物的免疫毒性有关。通过进一步对与炎症高度相关的IL-4,IL-5,IL-6,IL-10,IL-13,TNF-α,IFN-y和IL-1β等细胞因子进行研究,结果发现HCP组中没有检测到这8种细胞因了,表明OsrHSA的HCPs没有免疫毒性,也不可能出现细胞因子风暴的风险。为了研究水稻残留HCP的免疫原性,我们研究了 HCP特异性抗体,在给药后第14天,第28天和第41天分别检测了抗HCP、抗人血清白蛋白和抗OsrHSA的特异性抗体的效价和发生率。结果发现在给药后D41时,只有少数动物在OsrHSA和pHSA中检测到HCP特异性抗体,其发生率为在2/10,滴度均小于1.0,尽管检测到了特异性抗体,但发生率和滴度均较低,结果表明HCP具有较低的免疫原性。C-反应蛋白(C-reaction protein,CRP)水平会随着炎症发展而增加。在给药后D15时,OsrHSA组的雄性动物中CRP不但没有升高,反而有显著降低,并且在给药后42天时,OsrHSA和pHSA两中的CRP都显著降低。然而雌性动物的CRP显著降低;但这种变化与药物和给药时间之间没有相关性。CIC水平的上升作为抗药物抗体(Anti-drugantibody,ADA)发展的先决条件,我们检测了HCP的ADA,我们在给药后D15和D42天分别检测了CIC的水平。与阴性对照组相比,HCP组没有观察到任何与药物相关的CIC变化。进一步评估响应于HCP抗原的免疫激活反应,我们检测了补体3和补体4,结果表明:在pHSA组的补体3水平在给药后D15和D42较对照显著下降,而仅在给药后D42时,补充3水平仅在OsrHSA组的雌性动物有所增高,但所有处理组均没有检测到补体4。为了探讨在OsrHSA高剂量组可能引起的病理变化,我们对高剂量可能引起病理变化的肝、肾和脾脏等靶器官进行了组织学观察。在HCP组和阴性对照之间未观察到与药物相关的显著病理学差异,也没有发现HCP组的器官重量和系数比率的显著变化。对pHSA和OsrHSA高剂量处理组的病理学观察结果,在OsrHSA和pHSA组里发现了与药物相关的包括肝、脾和肾的器官/体重比增加;在OsrHSA和pHSA组观察到了肝细胞肥大,肝/脾造血,肾小球系膜细胞增殖和基质扩大,肾小管和肾小管变性/再生等在内的病理学变化。其发生率和严重程度与剂量高度相关,这可能是由于蛋白质过载引起渗透压增加从而降低肺功能所致,这些病变与每天高剂量注射白蛋白后的生物学特征一致。由于HSA主要用于治疗低血容量患者,因此这种现象不可能发生在病人身上。除肾小管病变在给药后D43后没有得到恢复外,其余病变均得到了恢复,这表明这些变化是一种可逆性反应,但这些病理学变化在OsrHSA和pHSA二者之间没有显著差异,表明OsrHSA与pHSA具有相似的毒性反应,说明OsrHSA是安全。为了在植物细胞中获得人源化的糖苷修饰,我们采用TALEN技术对水稻胚乳细胞编码糖苷修饰的酶进行遗传改造,总共构建了 9个靶向OsFUT的TALEN载体和11个靶向OsXylT基因TALEN载体,进行了水稻转化转化。我们先鉴定hpt的阳性转化植株,在此基础上,从hpt阳性植物中进一步筛选鉴定出GalT或FUT8阳性转基因植株,最终从67个hpt阳性转基因植株中获得了10个FUT8阳性转基因植株,从207个hpt阳性转基因植株中获得了46个GaIT阳性转基因植株;使用特定引物进一步鉴定目标基因是否通过NHEJ机制整合到由TALENs创建的DSB中,不幸的是,结果没有发现人类GalT或FUT8的插入到TALEN的靶标位点,显示设计的TALEN可能没有产生DSB。结果表明获得的GalT或FUT8的转基因植株均是通过随机方式整合到水稻基因组。随后,我们采用蛋白质印迹法对GalT或FUT8的阳性转基因株系的的表达进行了检测,检测结果发现:从10个FUT8阳性转基因品系检测到了3个转基因株系的胚乳中表达了FUT8,从46个GalT阳性转基因株系的胚乳中中检测到GalT的表达。进一步确定在表达FUT8和GalT蛋白的种子蛋白是否发生了N-糖基化结构改变,以TP309作为对照,采用MALDI-TOF质谱技术对阳性株系的糖苷结构进行了分析。结果显示所有表达FUT8的转基因品系种子均显示出不同的植物特异性N-糖苷结构;在过表达FUT8的转基因品系FF1-141-6的种子中,植物类型的糖苷结构较TP309显著降低了5%,只含木糖残基/无岩藻糖的N-糖苷如GnMX,MMX和GnGnX的总量显著降低,植物特异性糖苷的减少可能是由于哺乳动物特异性FUT8编码的基因表达所致。值得注意的是,在过表达GalT的转基因系胚乳中的植物类型N-糖苷的显著减少。可能是在胚乳中过表达人GalT基因,其机理可能是作用于GlcNAcMan5GlcNAc2的中心结构域并抑制植物类型N-糖苷的形成。我们发现在XG4-133-1和XG2-118-9转基因品系胚乳中缺少一种或两种植物特异性N-糖苷结构。在这个品系除了显著减少的植物类型N-糖苷结构之外,还检测到了人源特异性的半乳糖基化和唾液酸化的N-糖苷结构。在XG2-118-9转基因系中,在81%哺乳动物N-糖苷的26.44%糖苷被唾液酸化,这是首次在水稻胚乳细胞表达GalT基因产生了唾液酸化的糖苷结构。由于半乳糖基化结构作为唾液酸化的受体底物,早期研究报道在玉米、小麦和大麦等谷物作物物缺乏唾液酸化合成途径的相关基因,在植物中实现唾液酸化的N-糖苷较为困难。另一方面,已有报道在水稻基因组存在编码类似唾液酸转移酶的基因,在我们结果中,在转基因水稻中过量表达GalT,获得了具有唾液酸糖苷结构的N-糖苷,说明在水稻中较其他谷物作物具有更大的优势。由于糖基化药物的唾液酸化影响其循环半衰期和生物活性,在植物生物药物中的唾液酸与否是植物生物反应器与动物反应器的最重要差别。我们的结果提供了人源化糖苷修饰可在水稻胚乳细胞中实现的证据,也再次证明水稻基因组的唾液酸转移酶可以通过表达供唾液酸化的底物半乳糖来实现植物细胞的人源化糖苷修饰。综上所述,我们结果表明OsrHSA中的残留HCP的免疫原性较低,OsrHSA的安全性与血浆来源HSA相同。我们还证实了OsrHSA中的残留HCP对人体是安全的假说,再次证明水稻胚乳细胞是最适合的分子医药宿主之一。此外,在水稻胚乳细胞过表达人半乳糖苷转移酶(GalT)可以为唾液酸化提供半乳糖苷底物,并获得人特异的唾液酸糖苷结构和同时降低β-1,2-木糖含量。这些结果证明了 OsrHSA的HCP具有较低的免疫原性和免疫毒性,植物类型N-糖苷可以通过基因工程技术获得人源化的糖苷结构。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R91
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本文编号：2624308