绿原酸及其包合物对肺损伤保护作用的研究

发布时间：2020-04-13 20:55

【摘要】：肺损伤是由各种直接和间接致伤因素导致的疾病。肺损伤产生时,肺泡毛细血管内皮-上皮屏障受损、炎症细胞浸润以及氧化应激损伤等使得肺内聚集的大量中性粒细胞被激活;大量氧自由基和活性氧引起的氧化应激,造成弥漫性肺间质及肺泡水肿及低氧性呼吸功能不全。严重时可诱发急性呼吸窘迫综合征(ARDS),其发病率和死亡率一直居高不下,这对公共卫生健康造成很大影响。肺损伤的诱导因素包括肺部感染、吸入性损伤(包括有毒气体、胃酸反流、溺水等)、机械性损伤、放化疗的医源性肺损害、重症胰腺炎、脓毒血症或者严重非胸部创伤等。绿原酸是一种重要的生物活性物质,具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基和兴奋中枢神经系统等作用,已成为天然产物研究领域的热点之一。但是由于其具多个烷羟基和酚羟基,因此很不稳定,受热或者见光易分解,目前,绿原酸(CGA)在体内的抗氧化作用研究也较少。本文分两个部分:1基于绿原酸性质和肺吸入给药特点,将绿原酸制备成绿原酸包合物,通过气管插管给药使药物直接作用于肺组织,治疗过氧化氢(H_2O_2)致急性肺损伤(ALI)并评价其药效;2建立小鼠放射性肺损伤模型,并探讨绿原酸口服是否能够防治放射性肺损伤(RILI)),并初步探寻其潜在机制。1绿原酸包合物的制备及性质研磨法制备绿原酸包合物。按绿原酸:β-环糊精(β-CD)(mol:mol)为1:1的处方量,经冷冻干燥获得绿原酸包合物(CGA-β-CD)白色粉末。用HPLC法测定绿原酸包合物载药量达21.9%,漏斗法测定休止角为28.98±0.072°,流动性较好。绿原酸包合物的粒径D_(50)值为11.57±0.11μm。量筒法测定堆密度0.2040±0.0024g/cm~3,经计算得,空气动力学粒径(D_a)为5.35±0.046μm。扫描电镜观察CGA-β-CD粉末颗粒状,较为均匀。体外沉积率的测定绿原酸包合物粉末在肺部的沉积率达23.9%,可有效进入肺部深处。2绿原酸的细胞毒性四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法考察绿原酸对人支气管上皮BEAS-2B细胞的细胞毒性。MTT实验显示,在3.91~500μM浓度下的绿原酸对BEAS-2B细胞没有明显的毒性,绿原酸的安全性较好,在此浓度范围内可用于药效学考察。3绿原酸及其包合物对急性肺损伤大鼠的保护作用采用H_2O_2溶液经气管喷入建立急性肺损伤(ALI)大鼠模型后,动物分为5组:正常对照组;模型组;CGA-β-CD肺部给药组;CGA肺部给药组;地塞米松肺部给药组。HE染色观察肺组织病理变化,ELISA法检测肺泡灌洗液中的TNF-α和IL-1β含量,检测肺组织中还原型谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)含量。组织病理学显示CGA-β-CD与CGA对H_2O_2诱导的ALI有明显治疗作用;与模型组相比,CGA-β-CD组肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β明显降低,肺组织中MDA水平明显降低,GSH水平明显升高。CGA和CGA-β-CD能通过抑制炎性因子、减轻氧化损伤等作用减轻大鼠ALI。4放射性肺损伤模型的建立C57BL/6J小鼠全肺单次14、16、18Gy照射,剂量率为1.325Gy/min,观察小鼠一般情况和4周、8周的组织病理学变化,通过苏木精伊红染色法(HE)染色、Masson染色、ELISA法检测小鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β的水平等确定成功建立放射性肺损伤模型。组织病理学显示正常对照组小鼠的肺泡、毛细血管结构完整清晰,无渗血渗液等表现。模型组小鼠肺组织病理学在4周、8周均有组织间质充血水肿,大量炎性细胞浸润,及胶原纤维和细胞外基质的广泛沉积。模型组肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β明显升高(P0.01)。5绿原酸对放射性肺损伤小鼠的保护作用C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、照射对照组、给药治疗组(照射+预防治疗),阳性对照组氨磷汀(WR2721)组。照射对照组、给药治疗组(照射+预防治疗)和阳性对照组WR2721组小鼠用自行设计的固定、屏蔽装置对小鼠行单次X射线胸部照射,总剂量18Gy。分别于照射后4周、8周处死小鼠取材。照射后观察小鼠的一般情况,取第4周、8周小鼠右肺组织采用HE染色和Masson染色,观察各组小鼠肺组织病理学形态改变;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测各组小鼠在第4周、8周时采集的肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β含量;采用免疫组织化学染色法(IHC)检测各组小鼠4周、8周的肺组织中TNF-α、IL-β1、α-SMA蛋白表达。组织病理学显示CGA对RILI有明显治疗作用;与模型组相比,给药治疗组小鼠在4周、8周时,CGA组肺泡灌洗液中IL-6和IL-1β明显降低,表明CGA能通过抑制炎性因子等作用减轻小鼠RILI的早期肺损伤。6绿原酸对放射性损伤的Beas-2B细胞的保护作用及其机制探讨流式细胞凋亡检测绿原酸体外对放射性损伤的Beas-2B细胞凋亡的影响;通过γH2AX染色显示CGA对放射损伤Beas-2B细胞DNA损伤的保护作用;检测照射后细胞内ROS的产生荧光强度,表明加CGA预处理24h的Beas-2B细胞内ROS明显减少,从而保护肺上皮细胞。蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)检测炎症蛋白TGF-β1及COX-2蛋白表达,可以看到250μM CGA预处理组可以减少炎症蛋白的表达。
【图文】：

图 1 绿原酸（A）和 β-环糊精的结构（B）Figure 1 Structure of Chlorogenic acid(A)and β-CD(B)3 包合物

图 1-2 CGA、 β-CD、 CGA 和 β-CD 的物理混合物、 CGA-β-CD 的 X 衍射图 注：A.CGA B.β-CD；C. CGA 和 β-CD 的物理混合物；D. CGA-β-CDFig.1-2 XRD curves of CGA, β-CD, the physical mixture of CGAand β-CD,CGA-β-CD. A.CGA
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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本文编号：2626428