内源性ROS自稳态失衡对黑色素瘤细胞杀灭作用的研究

发布时间：2020-04-15 00:18

【摘要】：目的:应用siRNA干扰技术抑制人黑色素瘤A375细胞CBP、Nrf2基因表达,研究CBP、Nrf2基因沉默后对A375细胞的影响,从而为开发新型的核酸药物奠定一定的基础。方法:1、针对CBP、Nrf2基因mRNA序列分别设计合成1对特异性CBP siRNA和3对特异性Nrf2 siRNA,采用脂质体高效转染试剂LipoHigh介导siRNA转染到黑色素瘤A375细胞。2、实时荧光定量PCR技术用于检测转染48h后CBP、Nrf2基因的mRNA表达水平。3、siRNA转染后,采用CCK-8试剂盒检测A375细胞的增殖能力。4、碧云天活性氧试剂盒测定各组细胞ROS含量。5、采用PI染色结合流式细胞仪测定CBP、Nrf2 siRNA对A375细胞的周期分布。6、采用Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞仪测定CBP、Nrf2 siRNA对A375细胞的凋亡率。7、采用光学显微镜、DAPI染色检测不同时间点细胞或细胞核形态的变化。结果:1、Real-time PCR实验结果显示,与空白对照组相比,CBP siRNA和Nrf2 siRNA实验组中的CBP、Nrf2基因的表达量降低(P0.05)。2、A375细胞转染不同剂量的CBP siRNA、Nrf2 siRNA后,CCK-8结果显示,抑制CBP、Nrf2基因后,随着siRNA剂量的增加,细胞增殖率降低。3、A375细胞转染不同剂量的CBP siRNA、Nrf2 siRNA后,ROS结果显示,CBP siRNA、Nrf2 siRNA均使细胞内ROS含量升高,且共转染组比单转染组ROS升高的更明显。4、CBP siRNA使G2/M期比例下降(P0.05);Nrf2 siRNA可使A375细胞周期阻滞于S期(P0.05);共转染CBP、Nrf2 siRNA后使细胞发生S期阻滞。5、随着CBP siRNA(Nrf2 siRNA)剂量的增加,正常细胞比例较少,晚期凋亡数量增加,且与转染剂量有一定依赖关系。6、光学显微镜下观察细胞形态,空白对照组、阴性对照组细胞呈贴壁生长,细胞体积较大,随着培养时间的增加,细胞数逐渐增多。经CBP siRNA转染4h后细胞出现细胞质空泡化,随着培养时间的增加,细胞数减少。共聚焦荧光显微镜下观察,经CBP siRNA转染36h后细胞出现核固缩,核降解。经Nrf2 siRNA转染后可见部分细胞皱缩脱壁,胞间隙增大,细胞形态不规则。共聚焦荧光显微镜下观察,经Nrf2 siRNA转染细胞出现染色质聚集,染色加深,核降解。共转染CBP、Nrf2 siRNA后,细胞形态缩小,细胞质凝缩。共聚焦荧光显微镜下观察,共转染组在48h逐渐核降解消失。结论:1、CBP siRNA使肿瘤细胞内ROS升高,造成细胞质空泡化,这时的细胞并没有完全处于死亡,而是随着CBP siRNA转染时间的增加,细胞核出现染色质异常压缩,最终导致细胞死亡。2、Nrf2 siRNA使肿瘤细胞内ROS升高,促进肿瘤细胞死亡。主要通过影响细胞周期S期向G2/M期的转变过程,将肿瘤细胞阻滞在S期,减少进入G2/M期的细胞数目,从而抑制肿瘤增殖。3.共转染CBP、Nrf2 siRNA介导ROS大量产生,同时使细胞发生S期阻滞,促进细胞死亡。CBP并不是只参与Keap1-Nrf2-ARE途径调节ROS,也可能参与其他途径调节ROS水平。
【图文】：

转染,细胞,无差异,表达水平

组之间的CBP mRNA无差异（P＞0.05（）见表2-1，图2-1）。说P 表达。表 2-1 各组 CBP 基因 mRNA 表达水平（ x s，n=3）CBP mRNA 表达量l 0.989 0.044iRNA(1fmol/cell) 0.710 0.073*iRNA(2fmol/cell) 0.614 0.074**iRNA(3fmol/cell) 0.507 0.085**NA 0.967 0.03921.1100.000照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

增殖率

随着 CBP siRNA 剂量的增加，细胞增殖率降低（P＜0.01）胞增殖率与空白对照组相比，，差异无统计学意义（P＞0.0表 2-2 各组细胞增殖能力的比较（ x s，n=3）增殖率（%） 99.653 5.181NA(1fmol/cell) 83.266 6.831*NA(2fmol/cell) 72.906 4.701**NA(3fmol/cell) 55.418 8.694**NA 98.000 4.00036.2800.000照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R965

【相似文献】