嘌呤核苷类似物在10-23脱氧核酶功能优化中的应用研究

发布时间：2020-04-14 12:53

【摘要】：10-23脱氧核酶是一个具有高效催化裂解互补RNA的小型DNA分子,在分子、动物水平和临床试验研究证实了其作为基因治疗药物的巨大潜力。与反义核酸药物的封闭靶RNA或者依赖体内的核酸酶RNaseH剪切靶RNA不同,10-23脱氧核酶自身具有剪切靶RNA的能力。与siRNA类药物相比,脱氧核酶的DNA结构具有合成简便和易于修饰的优点。因此,发展脱氧核酶药物的关键是提高其催化裂解靶RNA的效率。10-23脱氧核酶依赖Mg~(2+)发挥催化活性,但人体细胞内的镁离子浓度不足以使其发挥高效的催化活性。本课题利用核苷类似物在10-23脱氧核酶催化结构域不同位点引入活性功能基胍基、咪唑基,通过这些活性功能基的引入,筛选能提高脱氧核酶催化活性的结构以及修饰位点。本课题设计了四种脱氧腺苷类似物,将胍基和咪唑基引入到了腺嘌呤碱基的6-位,8-位和8-氮-7-去氮-腺嘌呤的7-位。通过合成它们的亚磷酰胺单体,利用固相合成获得了24个脱氧核酶的修饰结构,分别取代了10-23脱氧核酶催化结构域的6个腺嘌呤位点(A5、A9、A11、A12、A15位,和处于识别臂的A0位),将胍基和咪唑基引入了催化结构域,其成氢键能力在催化结构域产生了新的相互作用。虽然这些催化结构域的修饰没有对脱氧核酶结合靶RNA的能力产生影响,但可能带来了局部的构象变化,这正是其影响催化效率的关键所在,是我们优化结构的切入点。我们将新合成的脱氧核苷类似物插入到这些位点,探讨其对10-23脱氧核酶催化活性的影响。已有的研究表明,在10-23脱氧核酶催化结构域的6个腺嘌呤位点,其6-氨基是一个能影响10-23脱氧核酶催化活性的功能基团,在此位点上以烷基臂引入额外的胍基(化合物12)和咪唑基(化合物14),在A9位获得了催化活性提高了3倍的脱氧核酶HJCZ10,以及活性提高了4倍的HJCZ22。这说明在A9位通过在嘌呤环6位引入胍基、咪唑基能有效地提高10-23脱氧核酶的催化活性。针对腺嘌呤的五员环修饰有两种,一种是在8-氮-7-去氮-腺嘌呤的7位,通过丙基引入了胍基(化合物13),在A9位得到了催化活性提高3倍的脱氧核酶HJCZ16;另一种是在腺嘌呤的8-位引入咪唑基(化合物15),没有得到催化活性提高的脱氧核酶,说明咪唑基产生的相互作用不利于催化构象。这些结果表明在腺嘌呤环上的6、7位是比较好的引入活性功能基团的位点,能够有效的提高脱氧核酶的催化活性,将化合物12、13、14、15引入到其它五个腺嘌呤位点和A0位,从实验结果来看,它们都是高度保守的单元。而A9是一个独特的位点,可以用于进一步修饰获得更高效的脱氧核酶。
【图文】：

脱氧核酶,筛选过程

没有发现天然的脱氧核酶。在 1994 年，Breaker 和 Joyce 运用体外自然进化过程（图 1-1），筛选得到了两个小型的 DNA 核酶，10-核酶，是具有裂解互补 RNA 的磷酸二酯键功能的单链 DNA 分子在基因治疗和基因功能研究，以及生物传感器研究中。鉴于脱氧核潜力，脱氧核酶的筛选技术有了很大的发展。越来越多的新型脱氧[9,10]。陆艺课题组筛选到各种金属离子-特异性的脱氧核酶，如 P导的的脱氧核酶[11,12]，最近他们又发现了一种新的脱氧核酶 NaA度 Na+下即显示出良好的活性，可用于细胞内 Na+成像的生物传感发现的第一个依赖单价离子发挥催化活性的脱氧核酶。随后，Liu了一种新的脱氧核酶 EtNa[14]，依赖 Na+发挥其催化裂解 RNA 的或者其他溶剂能加速其催化速率。另外，他们还筛选到了一系过渡的脱氧核酶[15,16]，例如依赖银离子的脱氧核酶 Ag10C[17]。

脱氧核酶

贵州大学 2019 届硕士研究生学位论文aiti 课题组在 10-23 脱氧核酶识别臂上分别引入 2 个 LNA 和 4 个 LNA 形成新脱氧核酶(LNAzyme)来特异性沉默 miRNA hsa-miR-372 和 hsa-miR-373[25]。实结果表明无论在体内或者在体外，经 LNA 修饰的 10-23 脱氧核酶，沉默活性到增强。并且具有四个 LNA 修饰的 LNAzyme 表现出比具有两个 LNA 修饰的好的活性。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R91

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