莲房原花青素对丙烯酰胺致神经细胞损伤的预防作用及机制研究

发布时间：2020-04-14 12:22

【摘要】：莲房原花青素(Lotus seedpod procyanidins,LSPCs)是从莲房中提取的一种类多酚类物质,其分子结构中含有富电子的羟基基团,具有很强的抗氧化能力,对神经毒性具有预防作用,但目前对其预防机制的研究较少。丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是人们日常生活中不可避免会摄入的一种食源性毒物,已知ACR能通过氧化应激反应引起神经毒性。从天然产物中筛选具有预防ACR神经毒性的营养成分,已成为预防ACR食源性毒性的有效策略之一。基于此,本论文利用化学体系和食品体系研究LSPCs对ACR生成的抑制或清除作用。在此基础上,选取星型胶质细胞/海马神经元共培养体系研究LSPCs对ACR致神经毒性的预防作用及机制,为LSPCs用于预防ACR神经毒性产品的开发提供理论基础和依据。主要研究内容和结果如下:1.LSPCs对ACR生成的抑制或清除作用利用模拟体温体系、美拉德反应体系和食品体系研究LSPCs对ACR生成的抑制或清除作用。反应体系中LSPCs的添加量为0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1.0%,反应产物通过气相色谱测定。结果,在模拟体温体系中,LSPCs的不同添加量对ACR含量没有显著影响,表明LSPCs对已生成的ACR没有清除作用。在果糖/天冬酰胺模拟的美拉德反应体系中,100、120、140、160、180℃五种温度下,LSPCs对模拟体系中ACR的生成均具有抑制作用,各温度下最大抑制率分别为31.79%、34.0%、44.83%、42.42%、39.61%,但其抑制率与添加量并不呈线性关系。100℃、120℃条件下,随着LSPCs剂量的增加,对ACR的抑制率不断上升,当温度达到140℃后,高剂量组抑制率开始出现不同程度的下降。在油炸薯片模拟的食品体系中,LSPCs的添加均能抑制ACR的生成,当LSPCs的添加量低于1.0%时,抑制率随LSPCs添加量而增高,其最大抑制率达到43.21%,但当LSPCs添加量超过1.0%时,抑制率开始下降。2.ACR致神经细胞损伤模型的建立采用刚出生24h内的SD大鼠,通过原位取材,建立星型胶质细胞、海马神经元细胞、星型胶质细胞/海马神经元共培养三种细胞模型,采用不同浓度的ACR(2、4、6、8、10μg/mL)对细胞进行染毒,观察细胞形态,并用MTT法测定其存活率,对三种细胞模型进行评价。结果,星型胶质细胞模型和海马神经元细胞模型细胞纯度均能达到90%以上,ACR对三种细胞模型均具有明显的损伤作用。其中,共培养细胞模型经染毒后,细胞存活率稳定性优于其他两种单一细胞培养模型,且更接近于人体的复杂环境,适用于后续实验。因此,以ACR的IC50值6.78μg/mL损伤共培养细胞48 h作为后续实验条件。3.LSPCs对ACR致共培养细胞损伤的预防作用及机制研究实验分为对照组、损伤组和预防组,对照组不做任何处理,损伤组以前文得出的损伤条件进行处理,预防组采用终浓度分别为2.5、5、10μg/mL的LSPCs提前4 h预处理后,再加入ACR共同处理共培养细胞。(1)通过观察共培养细胞形态变化、细胞存活率、细胞内[Ca~(2+)]i、活性氧(ROS)含量变化、细胞线粒体膜电位变化、谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量变化,研究LSPCs对ACR致神经损伤的预防作用。结果,经过LSPCs预处理后,神经细胞形态显著改善,细胞存活率提升。同时与损伤组相比,线粒体膜电位显著上升(P0.01),[Ca~(2+)]i、ROS含量显著下降(P0.01),GSH含量和GSH-Px活力显著上升(P0.01)。综上,LSPCs对ACR的神经毒性具有良好的预防作用。(2)采用Western blot测定共培养细胞氧化应激相关蛋白(Nrf2、HO-1、胞浆Nrf2),炎症因子NF-κB,神经细胞突触功能相关蛋白(包括突触可塑性相关蛋白SYN、Arc和β-Ⅲ-Tubulin以及突触后致密区蛋白PSD95)等蛋白含量的变化,研究LSPCs对ACR致神经损伤的预防机制。结果,共培养细胞经ACR损伤后,Nrf2、HO-1及胞浆Nrf2表达量显著上调(P0.01),同时总NF-κB及胞浆NF-κB表达显著上调(P0.01),经LSPCs预处理后,HO-1表达量下调(P0.01),胞浆中Nrf2和NF-κB发生核转移现象。ACR损伤后突触功能相关蛋白表达量均下降,LSPCs预处理组表达量上调。表明,ACR损伤神经细胞可导致细胞内ROS大量蓄积,谷胱甘肽大量耗竭,引起HO-1大量消耗,氧化应激通路被激活,神经突触功能受到损伤。经LSPCs预处理后,促进了Nrf2和NF-κB的核转移,神经突触功能受到保护。
【图文】：

标准曲线,标准溶液,气相,标准曲线

μL；进样口温度：240℃；检测器：FID；检测器温度：280℃程序：55℃ (1 min) → 15℃/min → 170℃ (3 min) → 3℃/min →n → 220℃ (6 min)。据统计中每组数据重复测定至少 3 次，采用 SPSS 16.0 软件统计数据数据间差异分析采用单因素方差分析，P<0.05 及 P<0.01 被认。与分析-DBPA 标准曲线的绘制DBPA 标准溶液气相色谱图如图 2.1 所示，标准曲线如图 2.2 所=1385.2x+6609.4，R2=0.9961。

标准曲线,标准曲线,溶液,环境体系

3-DBPA 溶液标准曲线Fig 2.2 Standard curve of 2,3-DBPA同体系下莲房原花青素对丙烯酰胺生成或清除的影响温环境体系 2.3 可以看出，，37℃条件下，ACR 的含量并不受 LSPCs 浓度量下，ACR 含量虽有波动，但其含量并未明显下降。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R99

【参考文献】