发展新型sirtuin底物和抑制剂及抑制策略

发布时间：2020-04-14 10:45

【摘要】：沉默信息调节因子2(Sir2)酶或sirtuins是细胞内具有β-NAD~+(或NAD~+)依赖性的蛋白N~ε-酰基赖氨酸去酰化催化活性的酶家族。这些酶在三类进化生命体(即细菌,古菌,真核生物)中都有存在,酵母Sir2是最先发现的sirtuin家族成员,在人类中已经发现了七个sirtuins,即SIRT1-7。蛋白赖氨酸N~ε-酰化和去酰化在生命过程中起关键调节作用,如调节代谢,基因转录,神经退行,细胞凋亡,细胞周期进展,衰老和细胞骨架组织。本论文工作从以下三方面对sirtuin家族进行了研究。(1)SIRT1/2/3去酰化反应的新底物的发展:虽然现已发展出不少用于体外测试的sirtuin去酰化反应的底物,主要的都是基于直链肽的。由于直链肽一般来说能被蛋白酶/肽酶降解并且不易透过细胞膜,所以这些底物不能用于检测细胞内sirtuin的去酰化催化活性,甚至也不能用于检测细胞裂解液中sirtuin的催化去酰化活性。基于本课题组以往成功地发展出多个sirtuin的环肽类催化机制导向的抑制剂,加上这类抑制剂作用机制的第一步是被sirtuin当做底物处理,所以在本论文工作中我们挑选出其中表现最佳的SIRT1/2/3环肽类抑制剂作为结构模板将其分子中的催化机制导向的基于赖氨酸的抑制弹头换为N~e-酰基赖氨酸,以期发展出代谢较稳定并能透过细胞膜的强效且具有选择性的SIRT1/2/3底物。这样的底物不仅能够像现有的底物一样用以构建sirtuin抑制剂(或激活剂)的筛选平台;当结合使用现已发展出的强效、选择性、能透过细胞膜的sirtuin抑制剂时,能透过细胞膜的环肽类sirtuin底物将可以用于评估细胞内各个sirtuin亚型的催化去酰化活性。通过SIRT1/2/3底物活性动力学参数的测定,以kcat/Km为准,我们发现化合物1-3,5具有很好的SIRT1底物活性,其中化合物1,3,5的底物活性都超过了目前文献报道的SIRT1最好的底物(kcat/Km=800M~(-1)s~(-1),且是个直链六肽)。化合物1-3,5的SIRT3底物活性也都超过了目前文献报道的SIRT3最好的底物(kcat/Km=990M~(-1)s~(-1),且是个直链六肽)。虽然化合物1-3,5的SIRT2底物活性(kcat/Km值)比目前文献报道的SIRT2最好的底物(kcat/Km=176×10~3M~(-1)s~(-1))低了约12.5-63倍,但是这个文献报道的底物是个直链九肽。由于在所有化合物(即1-3和5)中化合物5的结构最为精简,并且它的SIRT2底物活性和化合物3的SIRT3底物活性是所有化合物的SIRT1/2/3底物活性中最高的,所以化合物5被选出进行细胞实验以考察它是否能透过细胞膜在细胞内发生去酰化反应。初步细胞实验结果表明环肽化合物5可能不能通过细胞膜;这说明,虽然环肽比直链肽普遍有着强得多的细胞膜通透能力,但是这并不是说所有的环肽都能通过细胞膜。作为本部分工作的后续,考量其它化合物的努力正在进行中。(2)发展人类sirtuin抑制策略:Sirtuin催化的NAD~+依赖性的蛋白酰基赖氨酸去酰化反应的抑制剂的发展对于更全面地研究sirtuin生物学和药理学以及作为代谢和年龄相关疾病和癌症的潜在治疗剂具有重要价值。本课题组之前发现L-2-氨基-7-甲酰胺庚酸(L-ACAH)是个强效催化机制导向的sirtuin抑制弹头,这个发现与其a-碳和侧链酰胺氧之间的距离接近酰基赖氨酸中相应的距离有关,即L-ACAH的侧链也能像酰基赖氨酸侧链那样与sirtuin催化活性中心结合。为了微调L-ACAH的侧链使得a-碳和侧链酰胺氧之间的距离更接近酰基赖氨酸中相应的距离,我们设计并考察了含烯烃侧链的L-ACAH类似物作为催化机制导向的sirtuin抑制弹头的可能性以及功效。我们发现这个类似物似乎也是一个催化机制导向的sirtuin抑制弹头,但是它的抑制功效比L-ACAH弱(就SIRT1来说,弱了约7倍)。在本部分的论文工作中,我们还未能发展出比L-ACAH具有更强的催化机制导向的sirtuin抑制功效的L-ACAH类似物,但是后续工作仍在进行中。(3)发展新型疟原虫sirtuin PfSir2A的抑制剂:人类寄生虫sirtuins已被发现在各种条件下对寄生虫有促进存活的作用,所以这些sirtuins的几个抑制剂已被报道。对于恶性疟原虫中的PfSir2A来说,目前只有两个抑制剂已被报道,即烟酰胺(nicotinamide)和surfactin(文献报道的IC_(50)值分别为51.2mM和35.2mM),而且对于更强的抑制剂surfactin来说,相对于人类sirtuin的PfSir2A的抑制选择性也未知。在本部分的论文工作中,我们测试了本课题组已发展的9个人类sirtuin抑制剂(双齿类及催化机制导向的抑制剂)对于PfSir2A的抑制强度。化合物12被发现具有较好的对于PfSir2A的抑制强度及抑制选择性(相对于人类SIRT1)。PfSir2A抑制剂12的发现为我们进一步发展强效且具有选择性的PfSir2A抑制剂奠定了一个初步但是好的基础。与文献中的PfSir2A抑制剂surfactin相比,化合物12的抑制效果强了约4倍,并且化合物12的结构更精简;其分子的模块结构对于更进一步的构效关系研究也有利。本部分的论文工作也表明,有效利用人类sirtuin和寄生虫sirtuin的催化活性中心之间存在的结构差异将成为今后发展强效且安全的抗寄生虫病(特别是能对抗当前的耐药虫)的一个主方向。
【图文】：

赖氨酸残基的去酰化具有非常重要的调节蛋白结构和功能的意义[1-10]。第一个被鉴定出的被如此调控的蛋白是存在于真核细胞中的组蛋白，并且现在已经知道赖氨酸侧链乙酰化/去乙酰化也能够调节原核和真核细胞中许多除组蛋白之外的蛋白的结构和功能。从功能的角度来看，，通过赖氨酸侧链乙酰化/去乙酰化来调节蛋白已经被实验证明在细胞及生命体中的多种生物过程中起着非常重要的调节作用，如基因转录[11-14]，细胞周期进程[15-19]，细胞凋亡[20-23]，DNA 修复和代谢[24-26]。从机制的角度来看，这些功能可以是来自动态乙酰化和去乙酰化过程对所修饰的蛋白本身的结构调节，也可以是乙酰赖氨酸介导的与含溴结构域蛋白的特异性结合的结果。溴结构域代表与乙酰赖氨酸结合的蛋白模块家族，其含有约 110 个氨基酸残基并存在于许多染色质蛋白中，包括转录共激活因子，溴结构域和核蛋白的额外结构域（BET）家族，以及 ATP 依赖的染色质重塑复合物[27,28]。图 1.1 为这三组分过程的示意图。

江苏大学硕士学位论文而SIRT6能从酰基赖氨酸有效地去除长链脂肪酰基，如肉豆蔻酰基[43]。赖氨酸Nε-酰化有酶促和非酶促两种方式，典型的赖氨酸 Nε-乙酰化是通过酶促反应来实现的，由蛋白赖氨酸 Nε-乙酰转移酶（KAT）催化；而在线粒体基质内相对较高的pH 和酰基供体酰基辅酶 A 的浓度（mM 范围），线粒体基质中的乙酰化和琥珀酰化也可以通过非酶促实现。最近也有研究表明，乙酰磷酸也可以作为细菌中的乙酰供体用于非酶促蛋白赖氨酸 Nε-乙酰化[42,43]。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R91

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本文编号：2627213