金黄色葡萄球菌lux报告系统在新药发现中的应用

发布时间：2020-04-16 17:48

【摘要】：金黄色葡萄球菌在自然界中分布广泛,是院内感染的主要病原菌,能引起多种严重疾病。抗生素的发现是人类医疗史上的壮举,但由于抗生素的不合理使用,使耐药菌的出现层出不穷,其中包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。MRSA几乎对所有种类的抗生素表现出耐药性,唯独对万古霉素敏感,然而近年来甚至还发现了耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)。为了防止耐药菌的治疗陷入困境,需要开发一种新的方法去寻找环境中微量的抑菌活性物质。传统的药物发掘手段主要包括生物活性导向筛选、化学结构筛选和基因簇检测,存在着开发难度大、周期长、高通量筛选样品较为困难等缺点。为了克服这些问题,需要设计一种具有高灵敏度、高重复性、操作简便、适用于高通量快速检测环境样品的报告系统。本研究利用金黄色葡萄球菌热休克蛋白基因启动子构建了一系列lux报告菌株,在确认了实验室现有抗生素能够引起报告株的发光反应后,创新性地将其应用发酵液样品中抗生素的检测,并初步探究了该物质的分离纯化方法。按照作用机制不同,选取了七大类共16种抗生素来检测报告株的发光反应。借助小动物活体成像系统,成功捕捉到了抑菌圈周围的生物发光。其中,环丙沙星、加替沙星、达托霉素和丝裂霉素C能引起四种报告株的强烈发光,对于不同种类的抗生素,不同报告株的发光反应也不同。随后利用R语言对发光信号进行定量,使结果更为直观,并发现了报告株对抗生素存在三种不同的反应类型。由于药敏纸片法操作较为繁琐,需要制作双层平板且通量较小,所以本文对检测方法做了探究和优化。将报告株菌液加入96孔酶标版中,然后将待测样品加入到报告菌液里,利用酶标仪检测发光强度变化。最终从118株菌体发酵液中筛选出了3个能使报告株发光上调的样品,其中63号样品的抑菌圈最为明显。63号样品是一株小单孢子菌的发酵液,随后借助凝胶色谱、反相色谱和高效液相色谱对该抗菌物质进行分离,将其定位到了液相上的单一峰。由于该抗菌物质产量较少,本文对发酵条件进行了摸索,发现该菌株利用LB培养基发酵后能产生更大的抑菌圈。
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调控，

本文编号：2629865