质子泵抑制剂联合氟康唑抗耐药白色念珠菌的体内外作用及机制研究

发布时间：2020-04-16 20:17

【摘要】：背景:念珠菌引起的真菌感染在近些年来连续不断发生。在念珠菌中,白色念珠菌所致疾病是最常见。临床上,用来医治念珠菌病的药物种类有限且部分副作用大价格高。唑类药物高效低毒,广泛用于念珠菌感染,但随着感染的增多和用药量的增加,耐药株开始不断出现。为克服菌株的耐药性,现有药物增敏剂的研究受到了广泛关注。质子泵抑制剂(Proton pump inhibitors,PPIs)被发现可抑制白色念珠菌菌丝形成,且与氟康唑在临床联用可治愈念珠菌引起的急性食管坏死和念珠菌食管炎。尽管部分研究发现质子泵抑制剂联合氟康唑在体外无协同对抗敏感白色念珠菌的效应,但有研究发现D-octapeptide作为一种PPIs可增强氟康唑对耐药的白色念珠菌和都柏林念珠菌的作用,提示PPIs可作为氟康唑增敏剂的可能。迄今为止,没有研究证实PPIs能否增强氟康唑对耐药白色念珠菌的作用。目的:本研究的目的是评价质子泵抑制剂联合氟康唑抗耐药白色念珠菌浮游菌和预形成生物膜的体外药物相互作用,建立大蜡螟幼虫感染模型评价药物组合的体内相互作用,并深入探讨药物相互作用可能的机制。方法:首先,根据肉汤微量稀释法评价PPIs单用或联合氟康唑应用对抗耐药白色念珠菌的最低抑菌浓度,药物相互作用的结果采用分数抑制浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI)模型和△E模型进行评价。进一步研究,采用XTT实验方法测定药物联合应用在体外对耐药白色念珠菌预形成生物膜的抗真菌作用。其次,采用大蜡螟幼虫感染模型,进行耐药白色念珠菌感染和药物干预,观察幼虫的存活率和病理学组织切片,评价药物联合在体内的抗真菌效应。最后,采用罗丹明6G实验测定药物干预后耐药白色念珠菌外排泵活性,采用卵黄培养基测定药物干预后磷脂酶的活性,并通过显微镜观察药物组合对菌株菌丝生成的影响,探索药物联合潜在的抗真菌机制。结果:1.PPIs协同氟康唑体外对抗耐药白色念珠菌六种PPIs抗真菌活性较弱,但联合氟康唑体外抗耐药白色念珠菌浮游菌时,均可显著将氟康唑的最小抑菌浓度从512μg/mL降低至0.5-4μg/mL,计算所得FICI数据值在0.03-0.13之间,远小于0.5;所得∑△E值均为正值,其绝对值远大于200%。两种非参数模型评价所得结果相同,即药物相互作用结果被判定为强烈的协同效应。此外,六种质子泵抑制剂自身固有的的抗念珠菌活性和联合氟康唑的协同作用不尽相同。2.PPIs协同氟康唑抗耐药白色念珠菌的体外预培养生物膜对抗预形成时间较短的生物膜时,六种PPIs均可显著降低氟康唑的最小抑菌浓度,FICI值在0.06-0.25之间,均小于0.5,为强协同抗生物膜作用,且六种PPIs与氟康唑的协同抗生物膜作用不尽相同。对抗预形成时间为24 h的生物膜时,氟康唑的最小抑菌浓度均无明显降低,FICI值均为2,显示出无关的药物相互作用。3.PPIs联合氟康唑可增加大蜡螟存活率并减少其组织损伤实验所得生长对照组的大蜡螟存活率为25%,氟康唑与PPIs单用组的存活率在20%-35%之间,药物联用组的存活率在70%-85%之间。与氟康唑组相比,药物联用可明显提高感染的幼虫存活率(P0.05)。此外,在对照组和药物单用组中,可明显观察到面积较大的黑褐色菌团块散落在组织各处,而药物联用组的大蜡螟幼虫组织较为细密完整,且黑色团块面积较小,数量也较少。4.PPIs不影响耐药CA10药物外排泵活性与对照组比较,加有OME、LAN、PTP、RAB和ESO实验组的荧光强度变化无明显区别(P0.05),说明这五种质子泵抑制剂对CA10的外排泵活性无明显作用。加有ILA的加药组中,其胞内荧光强度下降程度明显强于对照组(P0.001),说明ILA可能促进了 CA10的外排泵活性,也可能是因为溶解度小生成的药物颗粒产生了荧光干扰了结果测定。5.PPIs联合氟康唑抑制白色念珠菌CA10磷脂酶活性和形态转变磷脂酶活性结果显示:药物联用组的Pz值为0.87±0.01,而未添加药物的对照组和药物单用组的Pz值均0.69。与对照组相比,药物单独使用组的Pz值与之非常相近,无统计学意义(P0.05);与其他组相比较而言,联合用药组均具备显著性差别(P0.0001)。在菌丝生长方面,药物联用组的菌丝长度明显比生长对照组和药物单用组短,且偶见圆形或卵圆形的酵母形态细胞。结论:PPIs可增强氟康唑的体内外抗耐药念珠菌活性,且可与氟康唑协同抗耐药念珠菌预形成的生物膜。机制研究结果提示,药物联合的协同抗真菌作用与抑制菌株磷脂酶活性和形态转变有关,可能与药物的外排泵活性无关。此研究将为抗真菌药物的研究和发现及克服真菌耐药性提供实验数据与新的研究思路。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

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