靶向IFNγ调控肿瘤微循环促进化疗药递送的机制研究

发布时间：2020-04-20 04:17

【摘要】：研究背景根据2018年最新的全球癌症统计报告显示,肺癌(lung cancer)仍然是全世界发病率与死亡率最高的肿瘤类型。而中国是全世界肺癌发病率与死亡率最高的国家之一。化疗仍然是目前治疗肺癌最重要的手段之一。顺铂(Cisplatin)是目前用于治疗肺癌的一线化疗药物。然而,化疗只能延缓疾病的进展,缓解率只有40%-50%。影响化疗效果的因素有很多,包括影响单个细胞摄取药物,代谢药物或者排出药物的基因突变,基因扩增或表观遗传改变。其中,化疗药物渗透不足是导致化疗失败的一个重要因素。肿瘤血管的异常,细胞外基质成分的组成差异,细胞间粘连,高间质液压等因素都可以限制化疗药的渗透。其中,肿瘤血管是大多数化疗药物到达肿瘤部位的第一道屏障,在化疗药物的递送中起重要的作用。化疗药除了可以杀死肿瘤细胞外,还能影响肿瘤血管内皮细胞,破坏血管。然而,化疗药对肿瘤血管的破坏反过来会减少后续化疗药物运输到肿瘤组织中并削弱杀死肿瘤细胞的效果,导致化疗失败。血管结构的完整性保证了化疗药物的正常输送。完整的血管结构由内皮细胞,内皮细胞之间的连接,周细胞和基底膜构成。传统的影响血管的因素如血管内皮细胞生长因子(VEGF),Dll4(Delta-like ligand 4),血管生成素1(Ang1)等主要影响内皮细胞的增殖,迁移和稳定。另外,内皮细胞的代谢对血管结构与功能的调节发挥着至关重要的作用。虽然对细胞代谢的研究已经开展了一个多世纪,但内皮细胞代谢从最近几年才受到越来越多的关注。内皮细胞的代谢主要依赖于糖酵解,且糖酵解的水平会随着疾病状态的变化而改变。据报道,抑制血管内皮细胞中的糖酵解激活剂6-磷酸果糖激酶-2/2,6-二磷酸果糖磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)可以使血管屏障变的更紧密,进而促进药物递送,增强化疗效果。然而,内皮细胞代谢调节血管结构和功能的机制研究的很不清楚。虽然化疗药可以通过抑制DNA复制或微管代谢所涉及的酶来直接清除分裂的内皮细胞,但是大部分的血管损伤可能是由于化疗诱导的炎症所导致的。在环巴胺诱导的肿瘤排斥过程中,巨噬细胞被激活产生干扰素γ(Interferonγ,IFNγ),进而抑制血管生成。IFNγ是一种多效性炎症因子,长期以来一直被认为是抗肿瘤免疫的重要效应分子,可以通过多种机制抑制肿瘤生长。反过来,IFNγ还可以促进具有免疫逃避表型的肿瘤细胞的生长。IFNγ影响肿瘤的一个重要机制是调节肿瘤血管。我们自己团队的研究表明,IFNγ在炎症作用下对脑内皮细胞的紧密连接有调节作用;IFNγ可以降低内皮细胞中Dll4信号通路的表达,降低血管周细胞上粘附蛋白N-cadherin的表达,将周细胞从血管中剥离,增加血管内皮细胞的通透性,进而促进肿瘤细胞的转移。但是IFNγ能否影响内皮细胞的代谢尚未见报道。在本文中,我们评估了中和IFNγ能否阻断顺铂诱导的肿瘤血管损伤并改善化疗药物的递送。研究目的本文主要探讨了中和IFNγ能否阻断顺铂诱导的肿瘤血管损伤并改善化疗药物的递送。并且引入代谢机制,证实中和IFNγ是通过降低内皮细胞糖酵解,限制乳酸的过量生成,阻断顺铂诱导的肿瘤血管损伤,而促进化疗药的递送,提高化疗效果。这为肺癌的临床治疗提供了一个新的思路和靶点。研究方法1)免疫荧光(Immunofluorescence,IF)方法检测单独注射顺铂或者顺铂与中和IFNγ联用对小鼠LLC肺癌肿瘤血管的影响。2)荧光定量PCR(Quantitative-PCR,Q-PCR)和细胞因子微球检测(Cytometric Bead Array,CBA)方法检测顺铂对小鼠LLC肺癌肿瘤组织中与血管相关的炎症性因子表达的影响。3)海马能量代谢检测IFNγ对内皮细胞(sEND.1)糖酵解水平的影响。4)流式细胞仪检测IFNγ对内皮细胞(sEND.1)糖摄入的影响。5)Western Blot检测IFNγ对信号通路蛋白及糖酵解相关蛋白的影响。6)用乳酸试剂盒检测IFNγ对内皮细胞(sEND.1)乳酸产生的影响。7)免疫荧光和western blot方法检测乳酸对内皮细胞(sEND.1)中血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)重分布和溶酶体活性的影响。8)渗透性实验检测乳酸对内皮细胞(sEND.1)渗透功能的影响。9)检测不同处理组:对照组,单独注射顺铂组,顺铂与中和IFNγ联用组,顺铂和中和IFNγ和乳酸联用组对肿瘤血管,化疗药递送及化疗效果的影响。研究结果在本研究中,我们发现顺铂在LLC小鼠肺癌模型中破坏了肿瘤血管,通过RT-PCR及CBA筛选发现首次注射顺铂第2天后IFNγ的水平升高。在该时间点中和IFNγ阻断了顺铂诱导的肿瘤血管损伤。接下来的研究发现,IFNγ通过激活AKT,升高内皮细胞糖酵解,最终促进乳酸的产生。乳酸促进溶酶体途径依赖的VE-cadherin的内吞和增强细胞内VE-cadherin的降解,从而破坏血管完整性。抑制乳酸的产生逆转了IFNγ诱导的VE-cadherin重分布。乳酸废除了中和IFNγ在体内对肿瘤血管的促进作用。最后,研究发现,特定时间点中和IFNγ促进了化疗药的递送,增强了化疗效果。乳酸破坏了中和IFNγ对化疗药递送的促进作用,降低了化疗效果。因此,我们的研究结果表明,通过中和IFNγ限制乳酸的过量产生可以阻断顺铂诱导的肿瘤血管损伤并改善药物递送。研究结论本研究发现顺铂通过诱导IFNγ破坏血管,特定时间点中和IFNγ阻断了顺铂对肿瘤血管的破坏。IFNγ通过升高内皮细胞糖酵解,促进乳酸的产生。乳酸通过激活溶酶体途径的VE-cadherin的内吞,破坏血管内皮细胞结构与功能。通过中和IFNγ,限制乳酸的过量生成促进化疗药的递送,提高化疗效果。
【图文】：

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图 1.1 LLC 肺癌移植瘤模型的构建流程图6 到 8 周龄雌性 C57BL/6 小鼠，皮下给予 1×106LLC 细胞，12 天后待肿瘤体积均超过200mm3左右时，开始腹腔注射顺铂（Cpt，，1mg/kg），隔天 1 次，一共 4 次。每隔 1 天观察并记录下小鼠肿瘤体积的变化，第 22 天处死小鼠，收取肿瘤组织。

周细胞,顺铂,内皮细胞粘附,免疫荧光方法

图 1.2 肺癌小鼠模型中顺铂对肿瘤血管结构的破坏A-C: 免疫荧光方法分析肺癌小鼠模型中注射顺铂对 CD31+肿瘤血管的密度（A），内皮细胞粘附连接蛋白 VE-cadherin 的分布（VE-cadherin+粘附连接沿着 CD31+肿瘤血管长度的百分比）（B）和 NG2+周细胞的覆盖（NG2+周细胞沿着 CD31+肿瘤血管长度的百分比）（C的影响。每组 6 只小鼠。标尺：100μm。数据表示为均值±标准误（***P<0.001）。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943

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