兴奋剂检测中区分克仑特罗来源及甲基屈他雄酮人尿代谢产物研究

发布时间：2020-04-22 02:10

【摘要】：第一部分兴奋剂检测中区分克仑特罗来源的研究克仑特罗是世界反兴奋剂机构明确列入禁用物质清单的蛋白同化制剂,它在临床上主要用于治疗哮喘。由于其具有较强的蛋白同化作用,又较容易合成,因此,在畜牧业中又被滥用为饲料添加剂用于增加养殖动物的瘦肉脂肪比,俗称“瘦肉精”。而由克仑特罗饲喂过的动物,会在其肌肉及内脏组织中残留,因而会引起二次污染甚至中毒的问题。运动员如果食用了被克仑特罗污染的肉食品有可能引起兴奋剂尿检阳性。世界反兴奋剂机构(World Anti-Doping Agency,WADA)报告检测结果的ADAMS系统中克仑特罗的阳性率也呈逐年明显上升趋势,全球范围内的克仑特罗阳性均有明显增加。克仑特罗在肉食品中的残留污染问题不仅在我国存在,世界其他很多国家,比如意大利、墨西哥、西班牙、葡萄牙和法国等都曾报道过克仑特罗在肉食品中的污染或中毒事件。因此,“如何在兴奋剂检测层面上区分食源性和药源性克仑特罗?”是一个国际体育界难题。由于克仑特罗化学结构中有一个手性碳,因此,它存在一对光学异构体,即R-(-)-克仑特罗和S-(+)-克仑特罗。但目前市售的克仑特罗均为外消旋体(即R/S比值等于1),其中有活性的是R-(-)-克仑特罗。早在2000年时,就有文献报道,克仑特罗的两种光学异构体在猪体内可食性组织中的残留存在差异,R/S比值小于1。因此,本论文以此为切入点,以中国运动员食用量最大的猪肉作为研究对象,探讨食源和药源克仑特罗的区分方法。目的:建立通过兴奋剂检测的方式区分食源性和药源性克仑特罗的方法,意在为误食被克仑特罗污染的肉食品而引发兴奋剂尿检阳性的运动员提供科学数据支持。方法:采用液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS),建立了血、尿以及组织中R型和S型克仑特罗两种异构体的区分方法并完成方法学验证。应用该方法,研究两种异构体在巴马猪体内的药代动力学及组织分布,并对26位受试志愿者分别进行人体食源性中猪肉来源和药源性克仑特罗的尿液代谢研究。通过对两组人体受试实验数据的分析,最终寻找区分食源中猪肉源和药源克仑特罗的判定依据。本文建立的血、尿和组织中区分R-(-)-克仑特罗和S-(+)-克仑特罗的检测方法,经方法学验证后均符合药物非临床药代动力学研究技术指导原则(2014版)和WADA颁布的实验室国际标准。结果:对巴马猪灌胃给药外消旋体克仑特罗后,其血中R/S比值均大于1,其尿液中R/S比值均小于1,其可食性肌肉组织中残留的R/S比值均小于1。对26位受试志愿者分别进行食源性克仑特罗和药源性克仑特罗人体受试,食源性克仑特罗经人体代谢后,其尿液中R/S比值为0.76±0.09,即0.67～0.85;药源性克仑特罗经人体代谢后,其尿液中R/S比值为1.09±0.07,即1.02～1.16。采用双边T检验对两组尿液中克仑特罗的R/S比值进行统计分析,结果存在显著性差异。结论:通过上述研究结果,可以得出以下R/S比值判定参考:(1)当运动员尿样中R/S比值大于等于0.67且小于等于0.85时,判断其为猪肉来源的克仑特罗;(2)当R/S比值大于0.85且小于1.02时,需要运动员提供食源性引入克仑特罗的其他证据,进一步确定其为猪肉来源;(3)当R/S比值大于等于1.02且小于等于1.16时,可以判断其为药源性来源克仑特罗;(4)当R/S比值小于0.67或大于1.16时,可以判断为非药源性克仑特罗,但需要进一步调查是否摄入其他来源的肉食品,如牛、羊等。本文建立的区分食源性和药源性克仑特罗的方法,将为误食被克仑特罗污染的肉食品而引发兴奋剂尿检阳性的运动员提供科学的判定依据。第二部分兴奋剂检测中甲基屈他雄酮人尿代谢产物研究在伦敦奥运周期(2012～2016年)中,兴奋剂检测技术上的最大进步,就是关于甾体类蛋白同化制剂长效代谢产物的研究。在2008年北京奥运会和2012年伦敦奥运会中,运动员尿样复检结果中报告阳性例数最多的也是长效代谢产物。因此,研究甾体类蛋白同化制剂在人尿中的长效代谢产物是目前兴奋剂检测领域的热点问题。甲基屈他雄酮是世界反兴奋剂机构在禁用物质清单中明确列出的甾体类蛋白同化制剂,它是目前未被研究的长效代谢产物中阳性较高的甾体类蛋白同化制剂之一。目的:通过对人体口服甲基屈他雄酮后的尿液分析,寻找其尿液中的长效代谢产物,以延长兴奋剂检测的时间窗口。方法:本研究首先通过LC-QTOF-MS中准确质量数和子离子扫描特征碎片寻找尿液中结合型代谢产物:葡萄糖醛酸结合型代谢产物(用G表示)和硫酸酯结合性代谢产物(用S表示);对不同保留时间流份前处理后GC-MS分析,推测代谢产物游离部分的甾环取代结构;针对游离型代谢产物再直接采取衍生化进行GC-MS分析,推测其结构。结果:对健康成人受试志愿者进行单剂量口服甲基屈他雄酮后的尿液进行研究时,发现了 15种代谢产物,其中6种游离型,7种G型,2种S型。并对每种代谢产物的检测时长进行了评估,所有代谢产物检测窗口在3-10天,其中G1和G2的检测窗口可达10天,为潜在的长效代谢产物。结论:本研究在人体口服甲基屈他雄酮后的阳性尿样中发现的长效代谢产物,根据WADA实验室国际标准,在兴奋剂检测同一批次中可以作为质控物质来确认运动员尿样中该物质的阳性。因此,本研究发现的长效代谢产物在兴奋剂检测领域具有重要的现实意义。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R917

【参考文献】