原儿茶醛对顺铂引起的急性肾损伤的防治作用及相关机制研究

发布时间：2020-04-22 23:17

【摘要】：顺铂(Cisplatin)是一个典型的化疗药物并广泛用于治疗不同类型的实体瘤中,包括卵巢和头颈部,睾丸和子宫颈等部位的癌症。但是,顺铂常常引起急性药源性肾病,表现为肾小管上皮细胞的损伤、血肌酐、尿素氮等的升高,明显降低肿瘤患者的生存率。众所周知,传统中药在治疗疾病时高效低毒,尤其是青蒿素治疗疟疾的成功运用,更坚定了人们对传统中药的研究。本课题组通过查阅文献,初步选出十种具有抗炎作用的中药单体,包括芦荟素、淫羊藿苷、原儿茶醛、原儿茶酸、葛根素等,结果发现,从传统中药唇形科植物丹参根部提取的中药单体原儿茶醛(Protocatechuic Aldehyde,PA)对顺铂引起的肾脏损伤可能具有治疗作用。本课题进一步检测原儿茶醛对顺铂引起急性肾损伤的保护作用并探索其作用机制,为防治急性肾损伤寻找潜在新靶点。课题主要从体内体外两方面展开,具体研究分为以下几部分:1.原儿茶醛减轻顺铂介导的急性肾脏损伤体内实验,顺铂腹腔注射建立急性肾损伤模型,分别给予原儿茶醛(0.45,0.9,和1.8 mg/kg)治疗,观察并对比模型组小鼠肾脏功能、肾小管形态学变化及肾脏损伤因子KIM1表达变化;通过PAS染色和尿NGAL和血肌酐尿素氮检测发现原儿茶醛可以降低顺铂引起的肾脏功能损伤以及形态学变化,同时这一结果在KIM1的蛋白印迹和免疫组化中证实;体外实验,以HK2细胞为实验对象,首先使用MTT实验观察原儿茶醛对顺铂介导的细胞死亡的保护作用,选出有效剂量,并对比观察模型组KIM1表达变化;结果显示,原儿茶醛在浓度为0.25,0.5,1 uM时,可以显著减轻顺铂诱导的肾小管上皮细胞死亡和KIM1表达;2.原儿茶醛减轻顺铂介导的炎症反应体内实验,使用real-time PCR和IHC检测相关炎症因子表达,结果显示原儿茶醛减轻急性肾损伤小鼠炎症反应;体外实验中,Real-time PCR和Elisa等方法,再次证实原儿茶醛降低顺铂诱导的HK-2细胞炎症反应;3.原儿茶醛减轻顺铂介导的细胞程序性死亡体内实验,使用Western blot方法检测细胞程序性死亡相关通路蛋白变化,结果显示原儿茶醛减轻急性肾损伤小鼠凋亡坏死水平;体外实验中,流式细胞术和Western blot方法,进一步验证了原儿茶醛减轻顺铂介导细胞程序性死亡的作用;4.原儿茶醛减轻顺铂介导的细胞氧化应激体内实验,使用GSH和MDA试剂盒以及IHC,Western blot方法检测Nox2和Nox4表达,观察氧化应激变化;体外实验,通过DCF和DHE试剂荧光染色观察氧化应激的变化;同时观察NADPH阻断剂APO对原儿茶醛治疗效果的影响,并进一步构建Nox2沉默细胞株和Nox4沉默细胞株,探索其作用机制。结果提示,原儿茶醛可以降低由顺铂引起的细胞氧化应激水平;同时,早期研究以及本课题发现APO或PA可以降低Cisplatin引起的肾小管上皮细胞损伤。但是,本实验使用NADPH抑制剂即APO后,PA不再发挥治疗其作用。因而,猜测NADPH可能是原儿茶醛治疗急性肾损伤的关键靶点。于是,进一步分析在肾脏中表达较高的Nox相关蛋白(Nox2和Nox4),并构建Nox2和Nox4沉默细胞株。在Nox2沉默细胞株中,原儿茶醛进一步减轻顺铂诱导的KIM1表达;但是,在Nox4沉默细胞株中,原儿茶醛不再发挥治疗其作用。由此证明,原儿茶醛对顺铂引起的急性肾损伤的治疗作用可能是以Nox4为作用靶点。另一方面,体内通过尾静脉注射慢病毒在体沉默Nox4,对比模型组,沉默Nox4减轻顺铂引起的肾小管形态学损伤,进一步提示Nox4可能是顺铂诱导的急性肾损伤的重要防治靶点。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

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