应用新型功能化金纳米载体介导的肿瘤靶向沉默BRAF基因联合光热效应治疗黑色素瘤研究

发布时间：2020-04-23 13:45

【摘要】：目的:创新制备一种具有肿瘤靶向、携带siRNA、同时产生光热效应三重功效的新型金纳米棒(Gold nanorod,GNR)纳米靶向系统FA-GNA-siRNA。探究该系统介导的RNAi技术靶向沉默小鼠黑色素瘤细胞(B16-BL6)中BRAF基因以及对肿瘤细胞生物学功能的影响,研究联合光热治疗法(Photothermal therapy,PTT)对小鼠黑色素瘤细胞凋亡的影响,以及探讨FA-GNA-siRNA介导的RNAi技术联合PTT对小鼠黑色素瘤的治疗效果。方法:1.GNR-FA采用种子合成法制备金纳米棒并进一步功能化修饰。透射电子显微镜(TEM)、紫外-可见光谱、核磁共振氢谱观察其大小和分散度、共振吸收峰、功能化修饰后的表面分子结构。2.MTT法检测修饰前后GNR对细胞的毒性。3.凝胶阻滞实验观察GNR-FA对siRNA装载效果。4.细胞流式技术检测FA-GNR-siRNA对B16-BL6细胞的转染效率。5.qPCR及Western Blot观察B16-BL6细胞/荷瘤小鼠BRAF基因/蛋白的沉默率及MEK-ERK信号通路相关蛋白表达量。6.划痕实验/Transwell迁移、MTT法、流式细胞术分别观察BRAF沉默迁移、增殖能力的变化。7.温度计监控GNR的光热效应;MTT法、流式细胞术检测GNR对细胞的光热效应、金纳米棒介导的RNAi技术联合PTT对B16-BL6细胞凋亡的影响。8.建立C57BL/6 B16-BL6荷瘤小鼠模型,采用透皮给药进行治疗,观察对肿瘤生长的影响。结果:1.GNR修饰后紫外吸收峰由发生明显的红移,透射电镜显示尺寸并未发生明显的变化,核磁共振氢谱进一步说明FA连接GNR成功。2.MTT法显示修饰后的FA-GNR毒性明显下降。3.凝胶阻滞显示GNR-FA与siRNA的质量比为3.5:1时为最适装载比例,可最大程度携带siRNA。4.流式细胞术结果显示GNR-FA对siRNA的转染效率明显高于GNR-PEI,并随浓度增加而增加,与荧光显微镜下观察一致,其转染效率受血清的影响较小。5.qPCR、Western blot结果显示体外BRAF在基因和蛋白水平沉默率均达到了80%以上。6.基因沉默BRAF后,黑色素肿瘤细胞增殖能力及迁移能力均明显下降,MEK-ERK信号通路P-MEK、P-ERK蛋白下调明显。7.在光密度4w/cm~2,激光照射5min的PTT效果明显,流式细胞术检测RNAi联合PTT明显促进B16-BL6细胞的凋亡。8.体内联合治疗组较其他对照组和治疗组明显抑制肿瘤生长速度、减小肿瘤体积、减轻肿瘤重量。结论:1.GNR-FA能够安全有效靶向导入siRNA并沉默B16-BL6细胞中的BRAF基因,改变其生物学特性,抑制肿瘤生长,促进肿瘤细胞的凋亡。2.GNR-FA介导的RNAi联合PTT可有效抑制B16-BL6黑色素肿瘤细胞在荷瘤小鼠的生长。
【图文】：

18图 1. 金纳米棒合成、功能化、表征、载药量及毒性A. GNR-FA 的 TEM 图 B. GNR-CTAB、GNR-PEI、GNR-FA 的紫外吸收图 C.GNR-CTAB修饰前后的核磁共振图谱（a:GNR-PEI 的核磁共振图谱；b: GNR-FA 的核磁共振图谱)D.FA-GNR 对 siRNA 的承载量 E. GNR-CTAB 、GNR-FA 对 B16-BL6 细胞的 24hrs、48hrs毒性.3.2 siRNA 肿瘤靶向递送和体外 BRAF 基因沉默接下来，我们通过 FA-GNR-siBRAF 测试了 siRNA 的靶向递送。据观察，只有 FA 引导的 GNR 可以有效地将 siRNA 递送至 B16-BL6 黑素瘤细胞，如在用FA-GNR-siRNA 孵育的细胞中观察到明显的 Cy3 标记的 siRNA 的红色荧光(图2A)。然而，，这在用非 FA 引导的对照纳米构建体 PEI-GNR-siRNA 孵育的细胞中

图 2. siRNA 肿瘤靶向递送和体外 BRAF 基因沉默A.GNR-FA 修饰前后转染的荧光照片（a,b 分别是 PEI-GNR-cy3-GAPDH 转染 4h 的荧光照片；c,d 分别是 FA-GNR-cy3-GAPDH 转染 4h 的白光和荧光照片 B. FA-GNRGAPDH 在 B16-BL6 细胞中的转染效率（流式细胞术**P=0.0018＜0.01，t 检验）C别是qPCR、Western blot检测体外沉默BRAF基因的效率（c是b的统计图），*P=0.013***P=0.0006<0.001，t 检验。3.3 siRNA 抗血清转染肿瘤细胞由于血清是有效转染 siRNA 的主要抑制剂，在血清存在下开发 siRN效递送系统一直是一项挑战。为了测试 FA-GNR-siRNA 是否具有血清抗在血清存在下体外转染细胞的效果，我们使用 FA-GNR-siRNA 在含有不浓度的培养基中不同时间段转染 B16-BL6 细胞，其基于纳米颗粒上蛋白和解吸在大约最初的几个小时达到平衡，并且约 6 小时后，细胞非靶向米颗粒数达到稳定[24,25]。将 B16-BL6 与 100μg/ ml Cy3-标记的 FA-GNR温育 4hrs，8hrs，12hrs 和 24hrs，不同浓度的血清从 0 到 100％。结果显示的转染效率高于其他时间段，可能是由于叶酸受体介导 B16-BL6 细
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.5;R943

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本文编号：2637796