肝癌靶向还原敏感型嵌段聚合物纳米胶束的实验研究

发布时间：2020-04-23 23:26

【摘要】：研究目的1)制备肝癌靶向、还原敏感型、载有超顺磁性氧化铁(SPIO)及抗癌药物阿霉素(DOX)的诊疗一体化纳米胶束(HA-SS-PCL@DOX/SPIO)并对其理化性质进行体外表征。2)通过体外细胞实验,探讨空白胶束(HA-SS-PCL)的安全性及载药胶束(HA-SS-PCL@DOX/SPIO)的细胞毒性、体外DOX释放效应,以及利用MRI对载药胶束抗癌药物靶向传递进行监测的可行性。3)通过体内动物实验,探讨载药胶束(HA-SS-PCL@DOX/SPIO)对裸小鼠人肝癌HepG_2细胞移植瘤的急性毒副作用,主动靶向性、还原敏感性以及利用MRI对其进行无创、实时、动态监测的可行性。研究方法1)纳米胶束(HA-SS-PCL@DOX/SPIO)的制备及表征:a)首先通过己内酯(ε-CL)的开环聚合反应,在十二醇引发剂的作用下,制备出聚己内酯(PCL);然后经过两步化学反应将PCL的端羟基转化成含有二硫键链接的氨基(PCL-SS-NH_2);然后以PCL-SS-NH_2为大分子引发剂,通过叠氮化谷氨酸酯环内酸酐(AELG-NCA)单体聚合成功制备出含二硫键的嵌段聚合物PCL-SS-PAELG;最后,通过“Click”反应,将炔基化透明质酸(HA)偶联到所合成的共聚物,形成HA-SS-PCL。最后,通过透析法将超顺磁性氧化铁(SPIO)、抗肿瘤药物阿霉素(DOX)高效负载于聚合物疏水性内核中。b)聚合物胶束理化性质表征包括:通过~1HNMR、FTIR表征聚合物HA-SS-PCL合成;利用动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)测量胶束粒径大小、形态及分布;采用芘荧光法检测临界胶束浓度;利用原子吸收法测量SPIO的负载率,利用紫外吸收法测量DOX包封率,并对胶束体外DOX释放进行测定。2)体外细胞实验a)利用四唑盐比色法(MTT)考察空白胶束HA-SS-PCL的安全性及载药胶束HA-SS-PCL@DOX/SPIO的细胞毒性。b)将Free DOX、HA-PCL@DOX/SPIO、HA-SS-PCL@DOX/SPIO纳米胶束分别与人肝癌HepG_2细胞共孵育后,分别进行荧光显微镜、流式细胞术及DAPI染色,从体外细胞水平观察载药胶束HA-SS-PCL@DOX/SPIO对人肝癌HepG_2细胞主动靶向机制。c)通过体外细胞MRI成像,观察载药胶束HA-SS-PCL@DOX/SPIO T_2WI信号强度变化情况,探索MRI评价人肝癌HepG_2细胞对纳米胶束吸收的可行性。3)体内动物实验a)建立裸小鼠人肝癌皮下移植瘤动物模型,约4~6周当肿瘤直径达1~2cm时,按分组要求,将21只裸鼠随机分成生理盐水组、HA-PCL@DOX/SPIO、HA-SS-PCL@DOX/SPIO组,每组7只,实验组经尾静脉按Fe 0.5 mg/kg注射胶束,对照组经尾静脉注射同等量的生理盐水,注射前及注射后不同时点(2 h、4 h、8 h)分别进行MRI成像,测量感兴趣区(肿瘤)T_2WI信号强度、T_2值及T_1值,计算信号变化率。不同扫描时间点各组分别后处死一只裸鼠,行常规HE染色和普鲁士蓝染色。b)建立裸小鼠人肝癌肝内原位移植瘤动物模型,约4~6周当肿瘤直径达0.5~1.5cm时,按分组要求,将12只裸鼠随机分成生理盐水组、HA-PCL@DOX/SPIO、HA-SS-PCL@DOX/SPIO组,每组4只,实验组连续3次间隔一天经尾静脉按DOX 2 mg/kg注射药物胶束,对照组经尾静脉注射同等量生理盐水。最后一次注射药物后24 h后处死裸鼠,行常规HE染色和普鲁士蓝染色。结果1)~1HNMR和FTIR证实聚合物纳米胶束HA-SS-PCL制备成功。DLS和TEM显示所制备的胶束符合纳米尺寸、均匀性好。紫外吸收法及原子吸收法分别显示DOX及SPIO负载效率高。体外释放实验证实HA-SS-PCL@DOX/SPIO对DOX的释放具有很好的缓释。2)体外细胞实验a)MTT试验显示一定浓度下的空白胶束HA-SS-PCL对HepG_2及LO_2细胞均有较好的相容性,安全性可。b)MTT试验显示载药胶束HA-SS-PCL@DOX/SPIO对DOX具有良好的释放,随着负载DOX浓度的升高,对HepG_2细胞杀伤力逐渐升高。c)荧光观察、DAPI染核以及流式细胞分析结果显示:Free DOX、HA-PCL@DOX/SPIO及HA-SS-PCL@DOX/SPIO组荧光强度存在显著差异;Free DOX组荧光最强、HA-SS-PCL@DOX/SPIO次之,HA-PCL@DOX/SPIO最弱。d)体外MRI成像显示HA-SS-PCL@DOX/SPIO组及HA-PCL@DOX/SPIO组其T_2WI信号强度明显低于空白对照组,而HA-SS-PCL@DOX/SPIO组较HA-PCL@DOX/SPIO组其T_2WI信号强度下降更为明显。3)动物实验a)成功建立了裸小鼠荷人肝癌皮下异位移植瘤动物模型及肝内原位移植瘤动物模型,HE染色证实其符合肝细胞癌模型。b)动物MRI成像显示:注射纳米胶束HA-PCL@DOX/SPIO、HA-SS-PCL@DOX/SPIO后肿瘤组织2 h、4 h其T_2WI强度较平扫时均有明显下降,后者下降更为显著。注射纳米胶束HA-PCL@DOX/SPIO、HA-SS-PCL@DOX/SPIO后肿瘤组织2 h、4 h、8 h其T_2值较平扫时均有明显下降,后者下降更为显著。注射纳米胶束HA-PCL@DOX/SPIO、HA-SS-PCL@DOX/SPIO后肿瘤组织各时间点其T_1值较平扫时均未见明显下降。c)普鲁士蓝染色证实不同时间点HA-SS-PCL@DOX/SPIO组肿瘤组织内见较多的蓝染的Fe颗粒,HA-PCL@DOX/SPIO组见较少的蓝染的Fe颗粒存在,以2 h为著,而生理盐水组未见蓝染的Fe颗粒存在。同时,结果进一步证实HA-SS-PCL@DOX/SPIO胶束主要集中分布于肿瘤组织内,其它脏器极少或无分布。结论1)本研究成功制备了一种新型肝癌靶向诊疗一体化的还原敏感型嵌段聚合物纳米胶束HA-SS-PCL@DOX/SPIO。2)制备的纳米胶束HA-SS-PCL@DOX/SPIO粒径小,大小均一,具有良好的水溶性、生物相容性、抗肿瘤效应,主动靶向性、强还原敏感型及MRI显像等多种功能于一体,具有较好的潜在应用前景。
【图文】：

路线图,嵌段聚合物,路线图,氩气

其间每天添加 20 mg 的氰基硼氢化钠。反应结束后用透析的方法进行提纯，，冷冻干燥得到白色产物 2.7 g，产率为 91%。由于透明质酸钠不能在 DMSO 中溶解，为了能够与 α-alkyne PZLL 进行点击反应，需要先用盐酸对透明质酸钠进行酸化处理。1.1.3.3 两亲性嵌段聚合物 HA-SS-PCL 的合成按照图 1-1（c）所示合成 HA-SS-PCL。具体步骤如下：首先将 0.22 g HA-N3（0.54mmol）与 0.1 g alkyne-SS-PCL 溶于 10 ml DMSO 中，并通入氩气驱走氧气。加入 15 mg CuSO4.5H2O，继续通入氩气 10 min，后加入 30 mg 抗坏血酸钠（NaAsc）。然后，将烧瓶在氩气下密封，并在 40℃的油浴中浸泡 3 天后将反应介质转移至截留分子量为 3.5 kD（MWCO）的透析膜，首先针对乙二胺四乙酸（EDTA）透析 3 天，然后针对纯水透析 3 天，以除去铜和抗坏血酸盐以及过量炔丙基乳糖。最后，经过透析与冻干，得到白色固体的最终产物 HA-SS-PCL（产量：0.146g，82％）。

谱图,氢谱,核磁,蓝色

1HNMR 表征图1-2 代表 α-alkyne-SS-PCL三种浓度的1H NMR谱图。α-alkyne-SS-PCL上的H质子峰如下：4.69 ppm (HC≡CCH2O-), 4.12～4.01 ppm(-COOCH2CH2-), 3.64 ppm(-NHCH2CH2-), 2.81 ～ 2.79 ppm (-CH2SSCH2-), 1.73 ～ 1.58 ppm(-COOCH2CH2CH2CH2CH2-) ，2.36～2.24 ppm (-CH2CH2COO-)，1.41～1.32 ppm(-COOCH2CH2CH2CH2CH2-)证明α-alkyne-SS-PCL已成功制备。图1-3 代表 HA-SS-PCL的1HNMR谱图。点击反应所生成的三唑环上质子峰出在7.6 ppm处（f），说明HA-N3与α-alkyne-SS-PCL在炔基上发生了化学反应，形成了新的化学键，表明HA-SS-PCL接枝共聚物已经成功合成。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943

【参考文献】